本文選題：骨組織工程　切入點：殼聚糖微球　出處：《武漢大學(xué)》2014年博士論文

【摘要】：與傳統(tǒng)支架比較,微球作為骨組織工程支架具有顯著優(yōu)勢：(1)微球可注射,能通過微創(chuàng)手術(shù)填充不規(guī)則的或復(fù)雜的骨缺損；(2)微球作為細(xì)胞載體,細(xì)胞/微球復(fù)合體可以直接植入體內(nèi),避免胰酶消化、離心等,操作方便,還能提高細(xì)胞活力；(3)微球作為藥物載體,能緩釋生物活性因子,進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化和體內(nèi)骨形成。 殼聚糖是一種天然聚合物,與細(xì)胞外基質(zhì)的多糖成分類似,具有良好的生物相容性、可降解性和可塑性,被廣泛應(yīng)用于載藥、組織工程等諸多生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域。作為一種性能優(yōu)越的支架材料,殼聚糖微球在骨組織工程領(lǐng)域也得到了廣泛的研究,然而,目前還存在許多問題有待明了。例如(1)在制備殼聚糖微球的過程中,干燥是必不可少的步驟。常用的方法有兩類：自然干燥法(將濕潤微球置于室溫、37℃或60℃的環(huán)境中,在空氣中干燥)和冷凍干燥法(先將濕潤微球置于-20℃、-80℃或液氮中冷凍,再轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)中干燥)。兩種干燥方法涉及不同的原理和過程,這是否會影響到殼聚糖微球的理化性能,進(jìn)而影響到生物活性分子的裝載、釋放和生物活性?(2)殼聚糖微球的制備方法多樣,包括凝集沉淀法、乳化交聯(lián)法、離子交聯(lián)法、噴霧干燥法等,不同的制備方法是否會影響到殼聚糖微球的理化性能和生物性能?從而影響到體內(nèi)的成骨效果?(3)作為骨組織工程支架,細(xì)胞須與支架復(fù)合,然后植入骨缺損區(qū)。細(xì)胞在復(fù)合前或復(fù)合后的狀況都可能影響到體內(nèi)的成骨效應(yīng)。細(xì)胞與支架究竟培養(yǎng)多長時間才最有利于體內(nèi)的骨生成? 上述問題,當(dāng)然并不僅限于以上問題,是殼聚糖微球支架應(yīng)用于骨組織工程中的常見問題,然而,相關(guān)的研究較少�；诖�,在本論文中,我們(1)選擇自然干燥法(37℃空氣中)和冷凍干燥法(-80℃C冷凍),以地塞米松為模型藥物,研究不同的干燥方法對殼聚糖微球的理化性能和載藥性能的影響；(2)選擇凝集沉淀法和乳化交聯(lián)法分別制備殼聚糖微球,并在微球表面仿生沉積磷灰石,研究這兩種制備方法對殼聚糖微球理化性能和磷灰石沉積的影響,并通過體內(nèi)、外實驗來評估殼聚糖微球的生物學(xué)活性；(3)選擇不同的體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)時間,研究大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)/殼聚糖微球復(fù)合體在修復(fù)骨缺損前是否需要成骨誘導(dǎo),以及不同的成骨誘導(dǎo)時間對微球支架修復(fù)骨缺損的影響。 第一部分兩種干燥方法對殼聚糖微球支架理化性能和載藥性能的影響 目的：研究自然干燥法和冷凍干燥法對殼聚糖微球支架理化性能和載藥性能的影響。 材料和方法：首先用凝集沉淀法制備濕潤的殼聚糖微球,然后選用自然干燥法和冷凍干燥法進(jìn)行干燥,檢測干燥微球的理化性能。以地塞米松為模型藥物,檢測藥物在殼聚糖微球中的包封率和釋放曲線,并通過檢測從微球中釋放的地塞米松對于大鼠BMSCs增殖、分化的影響,來評估地塞米松的生物活性。 結(jié)果：與冷凍干燥微球比較,自然干燥微球的溶脹率較低,降解速度較慢,洛氏硬度較大,裝載地塞米松的包封率較低,釋放速率較慢。細(xì)胞測試表明,兩種載藥微球均能顯著促進(jìn)BMSCs分化,而且促進(jìn)的程度相似。但與空白的未載藥微球比較,載藥的冷凍干燥微球抑制了BMSCs的增殖,而載藥的自然干燥微球?qū)?xì)胞的增殖無不良影響。 結(jié)論：干燥方法會影響支架的理化性能,進(jìn)一步影響地塞米松的裝載和釋放；自然干燥方法更適合于制備載地塞米松的殼聚糖微球。 第二部分兩種制備方法對殼聚糖微球支架修復(fù)骨缺損的影響 目的：研究凝集沉淀法和乳化交聯(lián)法對殼聚糖微球理化性能和磷灰石沉積的影響,并以大鼠BMSCs為種子細(xì)胞,評估磷灰石涂層的殼聚糖微球支架作為細(xì)胞載體用于骨組織工程的可行性。 材料和方法：分別采用凝集沉淀法和乳化交聯(lián)法制備殼聚糖微球,然后在微球表面仿生沉積磷灰石涂層。通過SEM觀察微球的表面形態(tài),采用XRD、FTIR分析涂層的成分,檢測微球的交聯(lián)度、溶脹率、降解率。分離、培養(yǎng)大鼠BMSCs,將BMSCs與微球進(jìn)行復(fù)合,檢測細(xì)胞在微球上的貼附、增殖和分化能力。最后將部分BMSCs/微球復(fù)合體植入大鼠皮下,分別于術(shù)后3、6、12周取材,通過HE染色來觀察微球促進(jìn)異位成骨的能力。另一部分BMSCs/微球復(fù)合體植入大鼠顱骨缺損,術(shù)后8周取材,通過Micro-CT分析和HE染色來觀察微球促進(jìn)正位成骨的能力。 結(jié)果：與凝集沉淀微球相比,乳化交聯(lián)微球具有較低的交聯(lián)度、較高的溶脹率和降解率、較多的磷灰石涂層。BMSCs在磷灰石涂層的乳化交聯(lián)微球上表現(xiàn)出最高的增殖、分化能力。皮下植入實驗顯示,在所有觀察時間點,均沒有明顯的骨生成。顱骨缺損植入實驗顯示,磷灰石涂層的乳化交聯(lián)微球修復(fù)骨缺損的能力最佳,成熟的新生骨基本修復(fù)了骨缺損區(qū)；磷灰石涂層的凝集沉淀微球修復(fù)骨缺損的能力次之,新生骨修復(fù)了大部分骨缺損區(qū)；無涂層的凝集沉淀微球修復(fù)骨缺損的能力再次之,新生骨修復(fù)了部分骨缺損區(qū)；而無涂層的乳化交聯(lián)微球修復(fù)骨缺損的能力最低,缺損區(qū)由纖維組織長入。 結(jié)論：制備方法會影響殼聚糖微球的理化性能和磷灰石的沉積,進(jìn)而影響B(tài)MSCs的生物學(xué)行為以及細(xì)胞／微球復(fù)合體促進(jìn)體內(nèi)成骨的能力；磷灰石涂層的殼聚糖微球可以考慮作為細(xì)胞載體用于骨組織工程。 第三部分不同體外成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)時間對細(xì)胞/殼聚糖微球支架修復(fù)骨缺損的影響 目的：研究BMSCs/殼聚糖微球復(fù)合體在修復(fù)骨缺損前是否需要成骨誘導(dǎo),以及不同的成骨誘導(dǎo)時間對體內(nèi)成骨的影響。 材料和方法：用凝集沉淀法制備濕潤的殼聚糖微球,自然干燥后,消毒備用。按實驗設(shè)計,在微球表面接種大鼠BMSCs,體外成骨誘導(dǎo)0、7、14、21天后,用CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的增殖,用PNPP法檢測ALP活性,用RT-PCR檢測成骨特異性基因包括ALP, COLI OCN的表達(dá)變化。最后,將處于不同分化階段的細(xì)胞/殼聚糖微球復(fù)合體植入大鼠顱骨缺損區(qū),術(shù)后8周取材,進(jìn)行Micro-CT分析和組織學(xué)檢測。 結(jié)果：細(xì)胞增殖從第0天到第7天顯著增加,從第7天到第21天增殖不明顯。第0天時,ALP活性較低,為基礎(chǔ)值。誘導(dǎo)7天后,ALP活性顯著高于0天組。誘導(dǎo)14天后,ALP活性達(dá)到高峰,隨后下降。RT-PCR檢測結(jié)果表明ALP基因表達(dá)變化趨勢與ALP活性結(jié)果一致。COL I基因的表達(dá)從第0天到第14天緩慢增加,第21天時,表達(dá)水平顯著升高(P0.05)。OCN基因的表達(dá)在第0天、第7天和第14天表達(dá)量很低,但在第21天時,表達(dá)量顯著升高(P0.05)。體內(nèi)實驗表明誘導(dǎo)0天組,新生骨量較少,微球之間和微球表面主要由纖維組織長入；誘導(dǎo)7天組,有明顯的新生骨,但缺損區(qū)中央缺乏骨形成；誘導(dǎo)14天組,新生骨量最多,幾乎將缺損斷端連成整體；誘導(dǎo)21天組,新生骨量與7天組類似,顯著低于14天組(P0.05)。 結(jié)論：BMSCs/殼聚糖微球用于修復(fù)大鼠顱骨缺損時,需要進(jìn)行成骨誘導(dǎo)分化,體外成骨誘導(dǎo)14天時,最有利于骨再生。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08

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