本文選題：鎂合金　切入點(diǎn)：鈣磷涂層　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2013年博士論文

【摘要】：研究背景 鎂是一種生物可降解金屬材料,但純鎂降解速率過(guò)快,產(chǎn)生大量氫氣,臨床應(yīng)用受到了限制。隨著合金技術(shù)的發(fā)展以及表面改性方法的應(yīng)用,可降解鎂合金的耐蝕性能和生物相容性有了極大的改善。 盡管鎂合金具有良好的生物相容性,但是其降解速度仍較快,為了進(jìn)一步減緩合金的降解速度,學(xué)者們進(jìn)行了一系列合金表面改性研究,形成了不同類型的合金涂層,不僅起到延緩降解的作用,而且還改善了其生物相容性。目前研究較多的有鈣磷涂層、氟化物涂層等。 但是作為骨科植入材料,其對(duì)于骨組織再生有無(wú)影響,將決定其是否能夠成為一種好的骨修復(fù)材料。對(duì)于骨再生過(guò)程中的關(guān)鍵細(xì)胞-成骨細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為及成骨分化過(guò)程有無(wú)影響尚不明確,對(duì)于骨骼運(yùn)動(dòng)的主要?jiǎng)恿ρb置一骨骼肌細(xì)胞的生物學(xué)行為影響也不明確。 本研究擬針對(duì)上述問(wèn)題,以空白或鈦合金為對(duì)照,對(duì)鎂合金、鈣磷涂層鎂合金、氟涂層鎂合金進(jìn)行進(jìn)一步的研究,研究鎂合金及其涂層對(duì)成骨生物學(xué)的初步影響,明確其材料的表面性質(zhì)、明確其對(duì)成骨細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,進(jìn)而明確其植入體內(nèi)后的血清鎂及局部骨骼的變化,明確其對(duì)骨骼肌細(xì)胞的生物影響,明確其對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)行為及成骨分化的影響。 目的 1、明確鎂合金及其涂層的表面形態(tài)及性質(zhì) 2、明確鎂合金及其涂層對(duì)成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響 3、明確鎂合金及其涂層植入體內(nèi)后的血清鎂變化、材料降解及成骨情況 4、明確鎂合金及其涂層對(duì)骨骼肌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響 5、明確鎂合金及其涂層對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響 6、明確鎂合金及其涂層對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響 研究方法 1、采用掃描電鏡研究鎂合金AZ31B、鈣磷涂層鎂合金CaP-AZ31B、氟涂層鎂合金F-AZ31B的表面形態(tài),用能譜分析研究其元素組成；通過(guò)將鎂合金及其涂層浸入細(xì)胞培養(yǎng)基中獲得浸提液,測(cè)定浸提液的PH值變化情況；通過(guò)蛋白吸附實(shí)驗(yàn)研究鎂合金及其涂層對(duì)蛋白的吸附能力。 2、通過(guò)采用鎂合金、鈣磷涂層鎂合金及氟涂層鎂合金的浸提液培養(yǎng)成骨細(xì)胞,進(jìn)而研究其細(xì)胞2、6及24小時(shí)的細(xì)胞黏附率,采用掃描電鏡研究其黏附形態(tài),采用倒置顯微鏡觀察1、3、5、7天細(xì)胞形態(tài),采用CCK法檢測(cè)成骨細(xì)胞1、3、5、7天增殖活力,采用Calcein-AM和EthD-1雙染觀察浸提液培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞存活情況,通過(guò)1、3、5、7天的磷酸酶測(cè)定及1、3、5、7天的細(xì)胞內(nèi)總蛋白測(cè)定來(lái)研究鎂合金及其涂層對(duì)成骨細(xì)胞功能的影響。 3、通過(guò)將鎂合金組、鈣磷涂層鎂合金組和聚乳酸對(duì)照組3組材料植入兔股骨,術(shù)后觀察兔子的大體行為及術(shù)后24小時(shí)、1周、4周、6周和8周的血清鎂濃度變化；術(shù)后8周處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物,通過(guò)大體形態(tài)、CT掃描及三維重建觀察植入材料的形態(tài)學(xué)變化情況；通過(guò)組織學(xué)觀察成骨情況；通過(guò)掃描電鏡觀察鎂合金及骨界面處的降解情況。 4、通過(guò)采用鎂合金、鈣磷涂層鎂合金及氟涂層鎂合金的浸提液培養(yǎng)骨骼肌細(xì)胞,進(jìn)而研究其細(xì)胞2、6及24小時(shí)的細(xì)胞黏附率,采用掃描電鏡研究其黏附形態(tài),采用倒置顯微鏡觀察1、3、5、7天細(xì)胞形態(tài),采用CCK法檢測(cè)骨骼肌細(xì)胞1、3、5、7天增殖活力,采用細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞有無(wú)凋亡,采用Calcein-AM和EthD-1雙染觀察浸提液培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞存活情況,采用1、3、5、7天細(xì)胞內(nèi)總蛋白測(cè)定來(lái)研究鎂合金及其涂層對(duì)骨骼肌細(xì)胞功能的影響。 5、從志愿者身上抽取骨髓,進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng),通過(guò)免疫組織化學(xué)方法鑒定骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；通過(guò)采用鎂合金、鈣磷涂層鎂合金及氟涂層鎂合金的浸提液培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞胞,進(jìn)而研究其細(xì)胞2、6及24小時(shí)的細(xì)胞黏附率,采用掃描電鏡研究其黏附形態(tài),采用倒置顯微鏡觀察1、3、5、7天細(xì)胞形態(tài),采用CCK法檢測(cè)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞1、3、5、7天增殖活力,采用Calcein-AM和EthD-1雙染觀察浸提液培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞存活情況。 6、通過(guò)鎂合金、鈣磷涂層鎂合金及氟涂層鎂合金置入成骨誘導(dǎo)液中獲得成骨誘導(dǎo)浸提液,進(jìn)而采用不同的成骨誘導(dǎo)液進(jìn)行骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化誘導(dǎo),通過(guò)細(xì)胞收集、引物設(shè)計(jì)、細(xì)胞RNA的提取以及逆轉(zhuǎn)錄等過(guò)程,以P-actin基因?yàn)閮?nèi)參,于成骨分化誘導(dǎo)后第6天和第12天研究各種浸提液中ALP、 COL I、OC、OPN和RUNX2基因的表達(dá)情況。 7、根據(jù)不同的數(shù)據(jù)類型,分別采用采用One-Way ANOVA、析因設(shè)計(jì)方差分析、重復(fù)測(cè)量方差分析及獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,多重比較應(yīng)用LSD法,方差不齊時(shí)采用Dunnetts T3比較。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。 結(jié)果 1、表面形態(tài)及性質(zhì) 1.1表面形態(tài)：鎂合金表面形態(tài)光滑,鈣磷涂層鎂合金表面形態(tài)粗糙,可見(jiàn)大量的鈣磷物質(zhì)沉積及晶體狀結(jié)構(gòu),氟涂層鎂合金表面表面均勻、光滑,在涂層表面可見(jiàn)分布有少數(shù)不規(guī)則小孔。 1.2能譜分析：結(jié)果表明鎂合金表面主要有鎂、鋁、鋅組成,其中鎂元素原子百分比約為96%,鋁約為3%,鋅約為1%；鈣磷涂層鎂合金CaP-AZ31B表面主要有鎂、鈣、磷及氧組成,其中鎂元素原子百分比約為0.33%,氧為63.39%,磷為17.6%5,鈣為18.63%；氟涂層鎂合金F-AZ31B表面主要是鎂、氟、鋁及鋅,其中鎂元素原子百分比約為56%,氟元素約為42.34%,鋁約為1.27%,鋅約為0.47%。 1.3浸提液的PH值變化情況：隨著時(shí)間的延長(zhǎng),鎂合金AZ31B、鈣磷涂層鎂合金CaP-AZ31B、氟涂層鎂合金F-AZ31B溶液的PH值都發(fā)生了改變,其逐漸向堿性環(huán)境轉(zhuǎn)化,但是鎂合金AZ31B浸提液的PH值升高最為顯著,遠(yuǎn)氟涂層鎂合金F-AZ31B溶液的PH值改變不顯著,鈣磷涂層鎂合金CaP-AZ31B溶液的PH值改變介于二者之間。 1.4蛋白吸附能力：鎂合金的蛋白吸附能力較鈦合金低,氟涂層的蛋白吸附能力較鎂合金稍高,鈣磷涂層鎂合金的蛋白吸附能力較其他三組顯著增高(P0.05),四組的蛋白吸附能力分別為26.95±3.17、25.27±2.02、70.2±5.57、27.70±2.00ug/ml。 2、對(duì)成骨細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響 2.1早期細(xì)胞黏附率：四組材料表面MC3T3-El細(xì)胞粘附率之間有顯著差異(F=259.434,P=0.000),組間比較顯示鈣磷涂層鎂合金組細(xì)胞粘附率顯著高于其他三組(P0.05),而鎂合金組細(xì)胞粘附率顯著低于其他三組(P0.05),其他兩組間無(wú)顯著差異(P0.05)。針對(duì)同組材料三個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)MC3T3-El細(xì)胞粘附率比較均具有顯著差異(P值均0.05)。四組之間細(xì)胞黏附率CaP-AZ31B組F-AZ31B組鈦合金組AZ31B組。加入四組材料浸提液后不同時(shí)間點(diǎn)MC3T3-El細(xì)胞粘附率有顯著差異(F=630.231,P=0.000),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),四組材料浸提液MC3T3-El細(xì)胞粘附率顯著增加,不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。且同一時(shí)間點(diǎn)四組材料浸提液MC3T3-El細(xì)胞粘附率比較差異均具有的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均0.05)其中所有組合交互效應(yīng)均顯著(F=21.78,P=0.000)。結(jié)合基本統(tǒng)計(jì)量輸出結(jié)果,最大均值(62.8%)的組合為培養(yǎng)24h時(shí)CaP-AZ31B組MC3T3-El細(xì)胞粘附率,最小均值(24.0%)為培養(yǎng)2h時(shí)AZ31B細(xì)胞粘附率。 2.2細(xì)胞黏附形態(tài)觀察 成骨細(xì)胞在三組材料表面黏附較好,鎂合金及其涂層表面成骨細(xì)胞貼壁展開(kāi),形態(tài)不規(guī)則,大多呈梭形,有較多突起,部分細(xì)胞間突起相互連接。 2.3細(xì)胞增殖活力 加入四組材料浸提液培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖活力比較有顯著差異(F=1491.2,P=0.000)；鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞活力均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,任兩個(gè)不同時(shí)間其細(xì)胞活力比較差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞活力四組總體比較具有顯著差異(F=143.6,P=0.000),多重比較顯示四組間任何兩組比較其差異均具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且總體F-AZ31B組增殖活力最大,其次是鈦合金組,CaP-AZ31B組次之,AZ31B組細(xì)胞增殖活力最小。其中所有組合交互效應(yīng)均顯著(F=9.15,P=0.000)。 2.4相對(duì)增殖率 鎂合金組的相對(duì)增殖率在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均小于80%,說(shuō)明鎂合金有一定毒性,按照毒性評(píng)級(jí)為2級(jí),但鈣磷涂層鎂合金組培養(yǎng)的MC3T3-El細(xì)胞相對(duì)增值率均80%,毒性評(píng)級(jí)為1級(jí),氟涂層鎂合金組培養(yǎng)的MC3T3-El細(xì)胞相對(duì)增值率均100%,毒性評(píng)級(jí)為0級(jí),為臨床骨科植入材料所接受。 采用析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示：鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞在不同時(shí)間上細(xì)胞增殖率無(wú)顯著差異(F=0.725,P=0.541)；且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞增殖率四組間總體比較具有顯著差異(F=534.57,P=0.000)；3個(gè)試驗(yàn)組的細(xì)胞增殖率均顯著低于對(duì)照組,四組間細(xì)胞增值率兩兩比較均有顯著差異,且從均值上看,其細(xì)胞增值率對(duì)照組CaP-AZ31B組F-AZ31B組AZ31B組。且培養(yǎng)時(shí)間及浸提液之間交互效應(yīng)顯著(F=2.01,P=0.048)。 2.5熒光染色 見(jiàn)鎂合金浸提液組培養(yǎng)的成骨細(xì)胞可見(jiàn)少量細(xì)胞紅染,但絕大多數(shù)細(xì)胞仍具有活性(綠染),鈣磷涂層鎂合金及氟涂層鎂合金組浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞無(wú)明顯紅染。 2.6堿性磷酸酶定量 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)均呈上升趨勢(shì),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1330.7,P=0.000),且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較均具有顯著差異(P0.05)。鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)水平四組間總體比較具有顯著差異(F=407.3,P=0.000);且多重比較結(jié)果顯示任兩組浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞堿性磷酸酶差異均顯著,且從均值上看,四組的堿性磷酸酶表達(dá)量依次為CaP-AZ31B組F-AZ31B組對(duì)照組AZ31B組。培養(yǎng)時(shí)間及細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)水平之間交互效應(yīng)顯著(F=25.8,P=0.000)。 2.7細(xì)胞內(nèi)總蛋白 鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=851.6,P=0.000)；且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較其細(xì)胞內(nèi)總蛋白量均有顯著差異(P0.05)。鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白量四組間總體比較具有顯著差異(F=4120.7,P=0.000);且多重比較結(jié)果顯示任兩組浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞堿性磷酸酶差異均顯著,且從均值上看,四組浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白量依次為CaP-AZ31B組F-AZ31B組對(duì)照組AZ31B組。培養(yǎng)時(shí)間及細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白量之間交互效應(yīng)顯著(F=30.9,P=0.000)。 3、骨植入實(shí)驗(yàn) 3.1術(shù)后兔子一般情況良好,術(shù)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血清鎂均在正常范圍內(nèi)。 3.2植入八周后聚乳酸幾乎完全降解,并且植入處與新生骨貼合緊密。鎂合金及鈣磷涂層鎂合金基本都維持較好的完整形態(tài),其中鎂合金骨質(zhì)外部分可見(jiàn)少許降解,邊界不清晰、不規(guī)則,鈣磷涂層鎂合金材料邊界清晰,未見(jiàn)到明顯降解痕跡。 3.3鈣磷涂層鎂合金組金屬與骨界面出可見(jiàn)較多新生骨形成,骨小梁排列緊湊而規(guī)則。無(wú)涂層鎂合金形成的新生骨較少。同時(shí)可見(jiàn)無(wú)涂層樣品的掃描電鏡提示其邊緣不規(guī)則,發(fā)生了降解,但鈣磷涂層鎂合金邊緣形狀同植入前變化很小。 4、對(duì)骨骼肌細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響 4.1骨骼肌細(xì)胞黏附率測(cè)定 四組材料表面兔骨骼肌細(xì)胞細(xì)胞粘附率之間有顯著差異(F=157.11,P=0.000),組間比較顯示鈣磷涂層鎂合金組細(xì)胞粘附率顯著高于其他三組,而鎂合金組細(xì)胞粘附率顯著低于其他三組,其他兩組間無(wú)顯著差異。四組之間細(xì)胞黏附率CaP-AZ31B組F-AZ31B組鈦合金組AZ31B組。加入四組材料浸提液后不同時(shí)間點(diǎn)兔骨骼肌細(xì)胞粘附率有顯著差異(F=874.783,P=0.000),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),四組材料浸提液兔骨骼肌細(xì)胞粘附率顯著增加,不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。其中時(shí)間與浸提液交互效應(yīng)均顯著(F=10.61,P=0.000)。 4.2細(xì)胞黏附形態(tài) 兔骨骼肌細(xì)胞在鎂合金、鈣磷涂層鎂合金及氟涂層鎂合金三組材料表面均表現(xiàn)黏附較好。 4.3細(xì)胞增殖活力 加入四組材料浸提液培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖活力比較有顯著差異(F=2022.53,P=0.000)；鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞活力均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,任兩個(gè)不同時(shí)間其細(xì)胞活力比較差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞活力四組總體比較具有顯著差異(F=50.68,P=0.000),多重比較顯示四組間任兩組比較其差異顯著(P0.05),且總體CaP-AZ31B組增殖活力最大,其次是F-AZ31B及鈦合金組,AZ31B組細(xì)胞增殖活力最小。其中所有組合交互效應(yīng)均顯著(F=5.43,P=0.000)。 4.4相對(duì)增殖率 鎂合金組的相對(duì)增殖率在第5及7d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)小于80%,說(shuō)明鎂合金有一定毒性,毒性評(píng)級(jí)為2級(jí),但鈣磷涂層鎂合金及氟涂層鎂合金組培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞相對(duì)增殖率均90%,毒性評(píng)級(jí)為1級(jí),為臨床骨科植入材料所接受。 采用析因設(shè)計(jì)的方差分析結(jié)果顯示：鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞在不同時(shí)間上細(xì)胞增殖率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=3.56,P=0.018)；且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間比較,除第1d和第5d,第1d和第7d細(xì)胞增值率有顯著差異(P0.05)外,其余各時(shí)間點(diǎn)間比較均無(wú)顯著差異(P0.05)。鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞增殖率四組間總體比較具有顯著差異(F=217.94,P=0.000)；3個(gè)試驗(yàn)組的細(xì)胞增殖率均顯著低于對(duì)照組,四組間細(xì)胞增值率兩兩比較均有顯著差異,且從均值上看,其細(xì)胞增值率對(duì)照組CaP-AZ31B組F-AZ31B組AZ31B組且培養(yǎng)時(shí)間及浸提液之間無(wú)交互作用(F=0.69,P=0.71)。 4.5細(xì)胞凋亡檢測(cè) 鎂合金浸提液可引起骨骼肌細(xì)胞凋亡,對(duì)照組、鈣磷涂層鎂合金組以及氟涂層鎂合金組流式細(xì)胞圖未見(jiàn)明顯細(xì)胞凋亡。 4.6熒光染色 可鎂合金浸提液組培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞可見(jiàn)部分細(xì)胞紅染,鈣磷涂層鎂合金及氟涂層鎂合金浸提液培養(yǎng)的骨骼肌細(xì)胞活性較好,如對(duì)照組一樣,未見(jiàn)明顯細(xì)胞紅染。 4.7細(xì)胞內(nèi)總蛋白 鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白量隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1796.8,P=0.000)；且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間兩兩比較其細(xì)胞內(nèi)總蛋白量均有顯著差異(P0.05)。鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白量四組間總體比較具有顯著差異(F=136.45,P=0.000)；且多重比較結(jié)果顯示：除CaP-AZ31B組與F-AZ31B組細(xì)胞內(nèi)總蛋白量比較無(wú)顯著差異(P0.05)外,其他各組間細(xì)胞內(nèi)總蛋白量差異均顯著,且從均值上看,四組浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白量依次為對(duì)照組CaP-AZ31B組F-AZ31B組AZ31B組。培養(yǎng)時(shí)間及細(xì)胞胞內(nèi)總蛋白量之間交互效應(yīng)顯著(F=7.15,P=0.000)。 5.對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)行為的影響 5.1骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定 流式細(xì)胞儀細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果提示CD34-、CD45-、CD44+、CD73+、CD90+、 CD105+。 5.2骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞黏附 四組材料表面兔骨骼肌細(xì)胞細(xì)胞粘附率之間有顯著差異(F=259.43,P=0.000),組間比較顯示鈣磷涂層鎂合金組細(xì)胞粘附率顯著高于其他三組,而鎂合金組細(xì)胞粘附率顯著低于其他三組,氟涂層與鈦合金組比較兩組間無(wú)顯著差異。四組之間細(xì)胞黏附率CaP-AZ31B組F-AZ31B組鈦合金組AZ31B組。加入四組材料浸提液后不同時(shí)間點(diǎn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附率有顯著差異(F=630.23,P=0.000),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),四組材料浸提液骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞粘附率顯著增加,不同時(shí)間點(diǎn)兩兩比較均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。其中時(shí)間與浸提液交互效應(yīng)顯著(F=21.78,P=0.000)。 5.3細(xì)胞增殖 鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞在不同時(shí)間上細(xì)胞增殖能力比較,結(jié)果顯示：加入浸提液培養(yǎng)后不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖活力比較有顯著差異(F=399.91,P=0.000);鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力均隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,任兩個(gè)不同時(shí)間其細(xì)胞增殖能力比較差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鎂合金及其涂層合金浸提液培養(yǎng)的細(xì)胞增殖能力四組總體比較具有顯著差異(F=37.14,P=0.000),多重比較顯示鎂合金組細(xì)胞增殖能力均顯著低于其他四組,鈣磷涂層及氟涂層鎂合金的細(xì)胞增殖能力較無(wú)涂層顯著改善,顯著優(yōu)于鎂合金組,與鈦合金組無(wú)顯著差異,且總體鈣磷涂層鎂合金組增殖活力最大,其次是鈦合金組,氟涂層鎂合金組次之,鎂合金組細(xì)胞增殖活力最小。對(duì)鎂合金降解液存在的PH升高問(wèn)題,調(diào)節(jié)PH值組鎂合金浸提液的細(xì)胞增殖能力與鈦合金組、和鈣磷涂層及氟涂層鎂合金無(wú)顯著差異(P0.05)。其中時(shí)間降解液交互效應(yīng)均顯著(F=2.32,P=0.011)。 五組熒光結(jié)果提示均可見(jiàn)到綠色染色的細(xì)胞,未見(jiàn)到明顯的紅色染色細(xì)胞。 6、對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響 提取的RNA較完整,純度較高。RT-PCR結(jié)果提示：鈣磷涂層鎂合金對(duì)于COLI基因、ALP基因以及OC基因表達(dá)有促進(jìn)作用。RUNX2基因表達(dá)量四組間無(wú)顯著差異。 鎂合金組的ALP表達(dá)量較低,調(diào)節(jié)PH值后ALP表達(dá)量與空白對(duì)照組無(wú)顯著差異(P0.05),鎂合金的OPN基因表達(dá)量在誘導(dǎo)分化后第6天和第12天均顯著高于其余三組(P0.05),調(diào)整PH值后的OPN基因表達(dá)量與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P0.05),提示PH值是引起鎂合金對(duì)于ALP基因和OPN基因的表達(dá)影響的可能因素之一。 結(jié)論 1、鎂合金AZ31B及氟涂層鎂合金F-AZ31B表面光滑,鈣磷涂層鎂合金CaP-AZ31B表面粗糙,可見(jiàn)晶體狀結(jié)構(gòu)。 2、三組鎂合金浸提液的PH值均出現(xiàn)增高,但氟涂層鎂合金性質(zhì)最為穩(wěn)定,單純鎂合金溶液的PH值升高顯著。 3、鈣磷涂層鎂合金對(duì)于蛋白具有更好的吸附能力,鎂合金及氟涂層鎂合金及鈦合金對(duì)于蛋白吸附能力無(wú)顯著差異。 4、鎂合金對(duì)于成骨細(xì)胞存在2級(jí)毒性反應(yīng),鈣磷涂層鎂合金及氟涂層鎂合金對(duì)于成骨細(xì)胞有著良好生物相容性。 5、鎂合金及其鈣磷涂層體內(nèi)生物相容性良好,血清鎂的濃度均為正常范圍內(nèi)；鈣磷涂層有效地延緩了鎂合金的降解,并可以促進(jìn)成骨作用。 6、鎂合金對(duì)于骨骼肌細(xì)胞存在2級(jí)毒性反應(yīng),鈣磷涂層鎂合金及涂層鎂合金對(duì)于骨骼肌細(xì)胞有著良好生物相容性。 7、鎂合金對(duì)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞存在2級(jí)毒性反應(yīng),鈣磷涂層鎂合金及涂層鎂合金對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞有著良好生物相容性。 8、鈣磷涂層鎂合金對(duì)于COLI、ALP及OC基因表達(dá)有促進(jìn)作用,無(wú)涂層鎂合金抑制ALP的表達(dá),且促進(jìn)OPN基因的表達(dá),但是調(diào)節(jié)PH值后重復(fù)研究發(fā)現(xiàn)其與對(duì)照組無(wú)顯著差異,提示其影響可能與PH值有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R318.08

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本文編號(hào)：1679511