本文選題：生物磷灰石結(jié)合肽　切入點(diǎn)：生物礦化　出處：《華中科技大學(xué)》2013年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：無(wú)機(jī)物表面識(shí)別基因工程肽是一類(lèi)來(lái)源于隨機(jī)肽展示系統(tǒng)的無(wú)機(jī)物。通常這類(lèi)生物活性分子能夠識(shí)別一些無(wú)機(jī)物的表面,并被廣泛運(yùn)用于藥物傳遞、醫(yī)學(xué)成像以及組織工程等領(lǐng)域。根據(jù)其結(jié)合底物的種類(lèi)不同,這類(lèi)小分子肽可以被廣義地分為三大類(lèi)。其中礦物結(jié)合肽能夠識(shí)別并結(jié)合于礦物類(lèi)無(wú)機(jī)物的表面,并可能在相應(yīng)礦物的礦化過(guò)程中起到活性調(diào)控分子的作用。本文首次提出經(jīng)過(guò)適當(dāng)處理的牙體硬組織為模版,結(jié)合噬菌體展示技術(shù)淘選獲取牙生物磷灰石的結(jié)合肽,并在體外礦化實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證上述結(jié)合肽影響鈣磷沉積的活性。 本研究的第一部分,首先通過(guò)平行和垂直牙冠長(zhǎng)軸的方向切割制備牙冠縱切面和橫切面,然后利用掃描電鏡觀(guān)察樣本表面形貌。樣本在溫和條件下進(jìn)行熱堿水解處理以降低表面的有機(jī)成分含量。利用高能量微區(qū)X線(xiàn)衍射技術(shù)及掃描電鏡技術(shù)相結(jié)合對(duì)處理前后的樣本進(jìn)行微觀(guān)形貌和晶體學(xué)性能的分析。結(jié)果提示用以下的方式制樣是獲得穩(wěn)定淘選用模版的可行方法：選用年輕恒牙為樣本以減少牙間差異所致的影響；統(tǒng)一在唇側(cè)牙冠中部取樣以減少牙內(nèi)變異所致的影響；近釉牙本質(zhì)界處牙釉質(zhì)和牙本質(zhì)在制備模版時(shí)應(yīng)予以排除因?yàn)榭紫逗陀袡C(jī)物含量較高；溫和的堿處理不僅可以減少牙體硬組織樣本表面的有機(jī)質(zhì)含量,還能去除因制樣受損所導(dǎo)致的晶體排列取向紊亂的表層。 在論文的第二部分,淘選模版被用于噬菌體展示的環(huán)肽系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)合肽的淘選。在底物結(jié)合、洗脫和結(jié)合肽收集等標(biāo)準(zhǔn)淘選程序中,分別使用單純化學(xué)洗脫和化學(xué)-物理復(fù)合洗脫兩種不同的方式收集結(jié)合肽。從第三輪和第四輪中挑選單克隆噬菌體進(jìn)行結(jié)合力分析。每種方法挑選出三十個(gè)單克隆分別計(jì)算噬菌體回收／投入比值,選擇具有較強(qiáng)結(jié)合力的單克隆進(jìn)行測(cè)序分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果發(fā)現(xiàn),兩種不同洗脫方式對(duì)于得到強(qiáng)結(jié)合力噬菌體結(jié)合肽來(lái)說(shuō)并沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的差異(P0.05)。總計(jì)有十四條不同的展示肽序列被認(rèn)為是具有較強(qiáng)結(jié)合力的,其中有兩個(gè)單克隆噬菌體展示的是同一條序列。 在論文的第三部分中,十四條含有不同展示肽序列的單克隆噬菌體儲(chǔ)液被添加進(jìn)微孔板凝膠系統(tǒng)以檢驗(yàn)其影響礦化的活性。絕大多數(shù)單克隆在凝膠系統(tǒng)中抑制鈣/磷的沉積的程度和WM13之間沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。但MR414和MR401添加劑組的終末產(chǎn)物量介于陰性對(duì)照和WM13之間(P0.05)。因此對(duì)這兩種噬菌體上所展示的序列進(jìn)行體外合成并分別驗(yàn)證合成環(huán)肽的牙釉質(zhì)親和力。熒光素標(biāo)記的MR414(-CMPQVMPMC-)和MR401(-CMPQVMPMC-)均能結(jié)合于牙釉質(zhì)并使樣本表面發(fā)出明暗相間的熒光。而在微孔板凝膠礦化實(shí)驗(yàn)中,合成環(huán)肽MR414(-CMPQVMPMC-)顯現(xiàn)出對(duì)凝膠中鈣/磷沉積量的抑制具有濃度效應(yīng)。相比之下MR401(-CMPQVMPMC-)則沒(méi)有上述的濃度效應(yīng)。模擬體液礦化實(shí)驗(yàn)中,MR401(-CMPQVMPMC-)添加劑組沉積物為針狀晶體為主混有少量的片狀晶體的混合體,且晶體有沿c軸擇優(yōu)取向排列的趨勢(shì)；MR414(-CMPQVMPMC-)添加劑組沉積物為針狀和片狀間雜的混合體且晶體以隨機(jī)取向排列為主。
[Abstract]:Surface recognition of inorganic genetic engineering peptide is a kind of random peptide display from the inorganic surface system. Usually this kind of bioactive molecules can identify some inorganic compounds, and are widely used in medical imaging, drug delivery, tissue engineering and other fields. According to the combination of different types of this kind of substrate, small molecule peptide is broadly divided into three categories. The mineral binding peptides can recognize and bind to the surface of the inorganic mineral, and may play a role in the regulation of the activity of molecular minerals in the corresponding mineralization process. This paper first dental hard tissue after proper treatment is put forward as a template, show binding peptide technology acquisition panning teeth the phage biological apatite, and mineralization in vitro experiments verify the binding peptides influence the activity of calcium and phosphorus deposition.
The first part of this study, first through the parallel and perpendicular to the axis of the crown cutting preparation of crown longitudinal section and transverse section, and then observe the sample surface morphology by scanning electron microscope. The samples were hot alkali hydrolysis treatment under mild conditions to reduce the content of organic compounds. The analysis and surface by high energy micro area x-ray diffraction technique and scanning the electron microscopic technique the morphology and crystallographic properties of the combination of the samples before and after treatment. Results in the following way is to obtain a stable sample selection method: Amoy feasible template selection for the sample of young permanent teeth to reduce the impact caused by differences between teeth; uniform in the labial crown central sampling to reduce the impact caused by the variation of teeth; near the enamel dentinal junction enamel and dentin should be excluded because of the high porosity and organic matter content in the preparation of template; alkali treatment can not only moderate To reduce the content of organic matter on the surface of the hard tissue samples, the surface of the crystal arrangement disorder caused by the damage of the sample can also be removed.
In the second part, panning the phage display template is used for peptide binding peptide panning system. In substrate binding, binding peptide elution and collection standard panning procedure, receiving binding peptide using a simple chemical elution and chemical physical compound eluted in two different ways. From the third and fourth rounds in the selection of phage binding analysis. Each method selected thirty monoclonal phage recovery / input ratio were calculated, with strong binding force of the monoclonal selection were sequenced. The results showed that two different elution method to get strong bonding force phage displayed peptide was not statistically significant difference (P0.05).. a total of fourteen different display peptide sequence is considered to have strong binding force, of which there are two monoclonal phage display the same sequences.
In the third part of this thesis, fourteen different peptide sequences containing monoclonal phage display liquid was added to microtiter plate gel system to test the effects of mineralization activity. The vast majority of monoclonal in gel system between WM13 and degree of inhibition of calcium / phosphorus deposition had no statistical difference (P0.05). But the MR414 and MR401 the additive group of end product weight between the negative control and WM13 (P0.05). So the sequence of the two phage display on the in vitro synthesis and verification of the synthesis of cyclic peptide affinity. Enamel fluorescein labeled MR414 (-CMPQVMPMC-) and MR401 (-CMPQVMPMC-) were combined with fluorescence in enamel and the sample surface issued white light. While in the microplate gel mineralization experiment, synthetic cyclic peptide MR414 (-CMPQVMPMC-) has shown effect on inhibition of gel concentration of calcium / phosphorus deposition. Compared to MR401 (-C MPQVMPMC-) no concentration effect. The simulated body fluid mineralization experiment, MR401 (-CMPQVMPMC-) mixture additive group sediment is needle like crystal mixed with a small amount of flake crystals, and the crystals along the c axis preferred orientation of the trend; MR414 (-CMPQVMPMC-) additive group is acicular and flaky sediment mixed mixed the crystal body and arranged in a random orientation.

【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R783.1

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本文編號(hào)：1642358