本文選題：基因工程多肽　切入點：水凝膠　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：基于基因工程多肽(genetically engineered polypeptide)的水凝膠(hydrogel)作為一種新型的生物材料,具有優(yōu)越的生物相容性和結(jié)構(gòu)可調(diào)性,在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。本論文主要包括多肽水凝膠的制備及作為支架材料用于三維(3 D)細胞培養(yǎng)和組織工程的研究；多肽微凝膠的制備及組裝構(gòu)建多孔水凝膠用于組織工程的研究；多肽PC10A(RGD)(P和A均為具有螺旋卷曲結(jié)構(gòu)的序列,C10是一段無序的水溶性序列,RGD是精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成的三肽序列)一熒光量子點(QDs)雜化納米水凝膠的制備及用于靶向生物成像的研究；不同電荷的多肽分子作為表面配體用于QDs的修飾及其靶向生物成像的研究。具體工作如下：(1)設(shè)計并合成了一種基于卷曲螺旋多肽P和聚乙二醇雙丙烯酸酯(PEGDA)的光聚合物理水凝膠,作為支架材料用于3D細胞培養(yǎng)和組織工程的研究。多肽Pcys或RGDPcys與PEGDA通過邁克爾加成(michael加成)反應(yīng)偶聯(lián)構(gòu)建光敏高分子單體P-PEG-acrylate/RGDP-PEG-acrylate。該單體在光引發(fā)劑I-2959和UV作用下形成光聚合物理水凝膠。水凝膠變性實驗及流變檢測結(jié)果均驗證該類水凝膠為物理水凝膠。流變結(jié)果還表明該水凝膠具有較高的機械強度和可調(diào)諧性的彈性模量。該水凝膠還具有優(yōu)良的溶脹性能和穩(wěn)定性,如10%(w/v)水凝膠的溶脹率和穩(wěn)定性分別是38%和15 d。愈合實驗顯示該物理水凝膠具有良好的自愈合特性,該特性可用于驅(qū)動介導(dǎo)微凝膠間的自組裝。細胞毒性實驗顯示該水凝膠材料具有優(yōu)越的生物相容性。細胞二維(2 D)表面生長實驗表明多肽水凝膠材料可以通過改變多肽成分(如引入細胞整合素RGD)來調(diào)節(jié)水凝膠表面對細胞的粘附性能。3 D細胞培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示,細胞可以在該物理水凝膠內(nèi)保持較高的細胞活性,且在26 h之后可以自由伸展和遷移。這些實驗結(jié)果都為多肽水凝膠在組織工程中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。(2)利用多肽物理水凝膠自愈合特性,以自下而上(bottom-up)的方式組裝負載有細胞(cell-laden)的微凝膠(microgel)構(gòu)建多孔水凝膠,并應(yīng)用于組織工程研究。在(1)的基礎(chǔ)上,合成光聚合物理微凝膠及cell-laden微凝膠。微凝膠表面多肽P間的動態(tài)自組裝驅(qū)動介導(dǎo)微凝膠的組裝構(gòu)建多孔水凝膠。微凝膠的尺寸與形狀可以通過光掩模調(diào)節(jié)控制,微凝膠的高度通過spacer(墊片)的高度來調(diào)控。此外,該微凝膠可以通過bottom-up和層層組裝的形式進行組裝。對比組裝水凝膠和非組裝水凝膠結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)組裝水凝膠內(nèi)的空隙大小與空隙連接性都遠優(yōu)于非組裝水凝膠。組裝水凝膠的多孔性非常適合營養(yǎng)成分及氧氣的輸送和代謝產(chǎn)物的排出,確保膠內(nèi)深層細胞的高活性。3D細胞培養(yǎng)實驗顯示,細胞在微凝膠合成以及組裝之后都能保持較高活性,并且在組裝24 h后可以自由伸展。實驗表明這種微凝膠的合成材料、合成方法及組裝方法非常適合用于模擬構(gòu)建“組織結(jié)構(gòu)”。(3)PC1oA多肽納米水凝膠(nanogel)作為載體包裹修飾疏水性熒光QDs,并應(yīng)用于靶向生物成像研究。用“熱變性-復(fù)性”方法處理低濃度多肽PC1oA水溶液制備PC1oA納米水凝膠顆粒。透射電鏡(TEM)結(jié)果顯示,納米水凝膠的尺寸可以通過多肽濃度來調(diào)控,尺寸范圍從20nm到300nm。TEM和EDXS(能譜儀)實驗結(jié)果表明,疏水性QDs可以均勻分散到納米水凝膠內(nèi)部,而且納米水凝膠內(nèi)的QDs負載量也具有可調(diào)性,但其具有一定飽和度。動態(tài)光散射分析顯示納米水凝膠具有良好的穩(wěn)定性(大于20d),且在負載疏水性的QDs后,納米水凝膠的穩(wěn)定性稍有增加。熒光光譜分析表明,疏水性QDs被納米水凝膠包裹轉(zhuǎn)水之后,仍具有很好的熒光強度(量子產(chǎn)率QY=33.5%),且熒光強度隨著pH值的增加而增強。MTT結(jié)果表明,單獨的PC10ARGD納米水凝膠對細胞無毒性,負載有適量疏水性QDs的PC10ARGD-QDs仍具有較好的細胞生物相容性,但是當(dāng)QDs濃度超過PC10ARGD納米水凝膠的負載范圍時,PC10ARGD-QDs表現(xiàn)出較高的細胞毒性。激光掃描共聚焦成像表明,多肽納米水凝膠PC10ARGD可賦予疏水性QDs良好的靶向性。因此,此種納米水凝膠適合作為載體用于包裹修飾疏水性納米顆粒,并賦予它們良好的生物相容性、水相穩(wěn)定性和靶向性等特性,在細胞靶向成像領(lǐng)域內(nèi)具有較大的應(yīng)用潛能。(4)利用不同電荷的多肽分子修飾水溶性QDs用于腫瘤細胞的靶向生物標(biāo)記。利用多肽A(帶負電荷)、B(帶正電荷)、ARGD和BRGD作為表面配體修飾CdSe@ZnS構(gòu)建探針QD-A,QD-B,QD-BA(近中性電荷),QD-ARGD和QD-BRGD。瓊脂糖凝膠電泳、粒徑和zeta電位實驗都證明不同電荷的熒光探針已被成功構(gòu)建。而且,QD-polypeptide的粒徑和zeta電位可以通過修飾不同的多肽來調(diào)控。毛細管電泳(CE)實驗結(jié)果表明,此類多肽與QDs的飽和摩爾比例為30：1。熒光光譜分析結(jié)果表明多肽的修飾對QDs具有熒光增強效應(yīng),大約增強2-3倍,且與電荷無明顯關(guān)聯(lián)。MTT結(jié)果顯示,單獨的多肽及QD-polypeptide均無急性細胞毒性,但QD-ARGD具有一定的慢性細胞毒性。因此,這類探針更適合短時程細胞熒光成像。激光掃描共聚焦成像結(jié)果表明,正電荷多肽B能夠促進細胞對探針的非特異性攝取,負電荷多肽A能夠抑制細胞對探針的非特異性攝取,負電荷與靶向分子在探針的細胞靶向攝入過程中具有協(xié)同效應(yīng),同時含有負電荷和靶向分子的多肽ARGD能夠有效提高細胞對探針的特異性靶向攝入。流式細胞儀實驗結(jié)果與激光掃描共聚焦成像結(jié)果一致。實驗結(jié)果表明,QD-ARGD探針具有高特異性細胞攝取、高熒光強度及低背景噪聲的優(yōu)點,在細胞靶向生物成像中具有很大的應(yīng)用潛能。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R318.08

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