本文選題：BMP9　切入點：間充質(zhì)干細胞　出處：《重慶大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：脊椎動物擁有的內(nèi)骨骼是由礦化的細胞外基質(zhì)組成的。骨骼是一種高度特殊性的連接組織,對于內(nèi)部器官具有保護性,能夠容納骨髓,作為鈣和磷酸鹽的保存組織,還是能量代謝的重要調(diào)節(jié)因子。成骨成軟骨祖細胞,成骨細胞和骨細胞是骨骼生成的三種基本細胞類型。正常的骨形成需要成骨細胞的分化,而成骨細胞又是由間充質(zhì)干細胞(MSCs)分化而來。近年來,隨著人們對于骨骼生長發(fā)育、骨骼疾病認識的加深以及科技的進步,形成了一門新的學(xué)科:骨組織工程學(xué)。骨組織工程是指將分離的自體高濃度成骨細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞或軟骨細胞,經(jīng)體外培養(yǎng)擴增后種植于一種天然或人工合成的、具有良好生物相容性、可被人體逐步降解吸收的細胞支架上,并加入一些誘導(dǎo)成骨的細胞因子。在這種生物材料支架上細胞可以按照支架的三維形態(tài)進行生長,并且進行營養(yǎng)物質(zhì)與氣體交換。然后將這種細胞、因子、材料的混合物植入骨缺損部位,在生物材料逐步降解的同時,種植的細胞不斷增殖與成骨分化從而達到修復(fù)骨組織缺損的目的。骨組織工程有三要素:足夠的成骨細胞,有效的誘導(dǎo)成骨因子,生物相容性良好的支架材料。我們之前已經(jīng)證明了BMP9是一個最有效的促進間充質(zhì)干細胞(MSCs)成骨分化的因子。而且我們之前也成功永生化獲得了一種間充質(zhì)干細胞iMEF,所以我們想找到一種材料,用BMP9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細胞后種植在這種材料上能夠讓細胞三維形態(tài)上生長成骨。這樣的實驗為生物材料在臨床誘導(dǎo)成骨提供了理論依據(jù)。我們首先用一種生物可降解的溫敏性大分子聚合物(PPCN)混合明膠(PPCN-G)作為一種支架材料來承載BMP9誘導(dǎo)的間充質(zhì)干細胞,測試其是否有促進骨形成的能力。這種材料PPCN在37℃會變?yōu)楣腆w,有利于材料在人體內(nèi)的固定,在21℃變?yōu)橐后w有利于材料與細胞還有因子的混合。實驗結(jié)果證明,在3D培養(yǎng)中明膠的加入能夠促進間充質(zhì)干細胞的粘附與生存。在小鼠背部的異位骨形成實驗證明PPCN-G能夠促進BMP9誘導(dǎo)的體內(nèi)成骨分化,并且能夠促骨小梁的生成以獲得更好的骨樣結(jié)構(gòu)。將背部的包塊取下做組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)PPCN-G能夠促進血管的生成。相應(yīng)的免疫組化結(jié)果證明PPCN-G能夠促進血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)的表達。所以我們的實驗證明了PPCN-G是一種新型的可注射可降解的載體,并且可以和細胞與因子一起用于骨組織工程。最近的研究表明BMP9誘導(dǎo)的骨形成和其他的BMP蛋白相比具有不同的分子機制。一些與生長發(fā)育有關(guān)的信號通路在BMP9誘導(dǎo)骨形成的過程中發(fā)揮了關(guān)鍵作用,他們與BMP9協(xié)同作用,共同完成骨骼發(fā)育和維持的任務(wù)。盡管許多在骨骼形成中的調(diào)節(jié)因子已經(jīng)被功能性地描述,比如說TAZ就具有明確的促進成骨分化抑制成脂分化的作用,但是TAZ對于BMP9誘導(dǎo)的成骨過程之間有什么關(guān)系,在成骨過程中它們是如何相互作用的還沒有研究清楚。這樣的研究對于骨組織工程中通過加入因子對成骨過程精確控制有指導(dǎo)意義。首先我們構(gòu)建了TAZ的siRNA沉默腺病毒并使用已經(jīng)得到的過表達腺病毒,然后將沉默或過表達的腺病毒與Ad-BMP9一起感染iMEF細胞,在體外進行堿性磷酸酶活性檢測,測試TAZ是否有促進成骨分化的能力。其次我們將TAZ過表達和沉默的腺病毒與Ad-BMP9一起感染iMEF細胞,然后與PPCN-G混合后注射到裸鼠皮下,與Ad-GRFP與Ad-BMP9一起感染的iMEF細胞的對照組進行對照,在體內(nèi)測試TAZ是否有促進成骨分化的能力。體內(nèi)外的實驗結(jié)果證明過表達TAZ和沉默TAZ都有促進BMP9誘導(dǎo)的成骨分化的能力,并且沉默TAZ之后的促進作用特別明顯,于是我們又將TAZ過表達和沉默的腺病毒與Ad-BMP9一起感染iMEF細胞,并且進行體內(nèi)和體外的細胞增殖檢測。證明了沉默TAZ能夠顯著促進iMEF細胞的增殖,可能是通過增加細胞間的相互接觸進而促進了iMEF細胞的成骨分化。我們用Ad-BMP9感染了iMEF和iMEF-OKmTAZ細胞后,在不同的時間點將細胞收集起來提取RNA,并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,將cDNA樣本進行各個譜系標(biāo)志物以及TAZ下游轉(zhuǎn)錄因子TEAD的qPCR檢測。實驗結(jié)果證明沉默TAZ的促成骨作用主要還是通過增強Runx2的表達來完成的,并且沉默TAZ對TEAD也起到了一定的抑制作用。所以我們的實驗證明了可以通過沉默TAZ來促進BMP9誘導(dǎo)的成骨過程。綜上所述,我的研究證明了通過使用溫敏材料PPCN-G與沉默TAZ都能夠有效促進BMP9誘導(dǎo)的成骨過程。
[Abstract]:The skeleton is composed of vertebrates with extracellular matrix mineralization. Bone is a highly connective tissue specific, with protection for internal organs, to accommodate the bone marrow, as calcium and phosphate metabolism or preservation of tissue, an important regulatory factor. Osteogenic chondrogenic progenitor cells, osteoblasts and bone cells are three basic cell types in skeletal formation. Normal bone formation requires the differentiation of osteoblasts and osteoblasts are composed of mesenchymal stem cells (MSCs) differentiation. In recent years, with the growth and development of bone, bone disease understanding and the progress of science and technology, the formation of a new subject: bone tissue engineering. Bone tissue engineering refers to the high concentration of autologous osteoblasts isolated from the bone marrow mesenchymal stem cells and chondrocytes, amplified and cultivated in a natural or artificial synthesis in vitro The good biocompatibility, cell scaffold can be gradually degraded and absorbed on the human body, and add some cytokines induced into bone. In this biological scaffold cells can grow in accordance with the three-dimensional morphology of scaffolds, and nutrient and gas exchange. Then the cells implanted into the bone defect site factor. A mixture of materials, in biological materials gradually degraded at the same time, the plant cell proliferation and osteogenic differentiation to repair bone tissue defect. Bone tissue engineering has three elements: sufficient osteoblasts, effective osteoinductive factor, good biocompatibility of scaffold materials. We have proved that BMP9 is one of the most effective promotion of mesenchymal stem cells (MSCs) into bone factor differentiation. And we also successfully obtained before an immortalized mesenchymal stem cells iMEF, so we want to find A material with BMP9 induced mesenchymal stem cells after planting can make 3D cell morphology growth of osteoblasts on this material. This experiment provides a theoretical basis for the biological material in clinical bone induction. We first used a temperature sensitive biodegradable high molecular polymer (PPCN) mixed gelatin (PPCN-G) as a scaffold to carry BMP9 induced mesenchymal stem cells, to test whether there is the ability to promote bone formation. This material PPCN will become solid at 37 DEG C, in favor of material fixed in the body, at 21 DEG C into a liquid material and is beneficial to the cell and the mixed factor experimental results show that, in the culture of 3D gelatin could promote mesenchymal stem cell adhesion and survival. Experiments show that PPCN-G can promote BMP9 induced osteogenic differentiation in vivo in mice heterotopic bone formation, and can promote bone trabecula The formation of bone like structure in order to get better. The back of the bag piece removed for histological analysis showed that PPCN-G can promote the formation of blood vessels. The immunohistochemical results show that PPCN-G can promote vascular endothelial growth factor (VEGF) expression. So our experiment proved that PPCN-G is a new type of carrier injection of biodegradable, and can and cell factor for bone tissue engineering. Recent studies suggest that BMP9 induced bone formation and other BMP protein compared with different molecular mechanisms. Play a key role in some growth related signaling pathways to induce bone formation in the process of BMP9, BMP9 and their synergistic effect, to complete the development and maintenance of bone task. Although many in bone formation in regulating factor has been described to function, such as TAZ has clear to promote osteogenic differentiation inhibition Made of fat differentiation, but TAZ for BMP9 induced into what is the relationship between bone formation in bone, in the process of how they interact has not been studied clearly. This research for the factors on the osteogenesis process by adding the accurate control of significance in bone tissue engineering. Firstly, we constructed a TAZ siRNA silence has been the use of adenovirus and expression of adenovirus, and then silencing or overexpression of adenovirus with Ad-BMP9 infected iMEF cells, detect alkaline phosphatase activity in vitro, to test whether TAZ can promote the osteogenic differentiation capacity. Then we will TAZ over expression and silencing of Ad-BMP9 with adenovirus and iMEF infection the cell, then mixed with PPCN-G injected into nude mice, the control group with Ad-GRFP infection and Ad-BMP9 iMEF cells were compared in vivo test whether TAZ can promote bone points The ability of the in vivo results demonstrated that overexpression of TAZ and TAZ have the ability to promote bone silence differentiation induced by BMP9, and the silence after TAZ to promote special effect, so we have the over expression of TAZ and adenovirus and Ad-BMP9 silencing with the infection of iMEF cells, and the cells in vivo and in vitro the proliferation of detection. It is proved that silencing of TAZ can significantly promote the proliferation of iMEF cells, probably by increasing the mutual contact between cells and promote the osteogenic differentiation of iMEF cells. We infected iMEF and iMEF-OKmTAZ cells by Ad-BMP9, at different time points were collected and extracted RNA, reverse transcription cDNA, will the cDNA samples for each lineage markers and TAZ downstream of the transcription factor TEAD qPCR detection. The experimental results show that the osteogenic effect of silencing TAZ mainly through enhancing the expression of Runx2 to complete the, And the silence of TAZ TEAD also has played a certain effect. So we can prove by silencing TAZ to promote bone formation induced by BMP9. In summary, our research proved that through the use of temperature sensitive materials PPCN-G and TAZ are silent can effectively promote bone formation induced by BMP9.

【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R68;R318.08

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本文編號：1606755