本文選題：骨組織工程　切入點(diǎn)：脂肪來(lái)源干細(xì)胞　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2013年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：背景： 骨缺損的修復(fù)一直是骨科臨床亟待解決的難題之一。近年來(lái)，隨著組織工程的空前發(fā)展，應(yīng)用組織工程化骨修復(fù)骨缺損成為了研究熱點(diǎn)。骨的再生是一個(gè)多因素相互作用的復(fù)雜過(guò)程，這一過(guò)程中，許多生長(zhǎng)因子發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，其中骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins, BMPs）與成骨誘導(dǎo)有著密切的關(guān)系。BMP家族成員中，，BMP2具有最高的成骨誘導(dǎo)活性，同時(shí)，研究表明，BMP7可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和新骨形成。因此，我們推測(cè)共表達(dá)BMP2和BMP7可能更有利于ADSCs細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化以及轉(zhuǎn)化后細(xì)胞的增殖，從而在體內(nèi)更好地促進(jìn)骨組織的生長(zhǎng)和愈合。 目的： 以人工合成β-TCP鈣磷陶瓷為支架材料，復(fù)合BMP2與BMP7聯(lián)合基因修飾的大鼠脂肪來(lái)源干細(xì)胞(adipose derived stem cells,ADSCs)，研究構(gòu)建組織工程骨的可行性。 方法： (1)大鼠的脂肪來(lái)源干細(xì)胞（ADSCs）的分離培養(yǎng)、體外擴(kuò)增，以及細(xì)胞表面標(biāo)志和分化潛能檢測(cè)。 (2)分別構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白(GFP)的BMP2重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒及攜帶紅色熒光蛋白(RFP)的BMP7的重組慢病毒表達(dá)質(zhì)粒。以Lv-BMP2轉(zhuǎn)染ADSCs、Lv-BMP7轉(zhuǎn)染ADSCs和Lv-BMP2、Lv-BMP7共轉(zhuǎn)染ADSCs，另設(shè)未轉(zhuǎn)染ADSCs作為對(duì)照。并以Realtime PCR和Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中BMP2和BMP7基因的mRNA和蛋白表達(dá)情況。應(yīng)用Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染后14天各組細(xì)胞骨鈣素(OCN)和Ⅰ型膠原的蛋白表達(dá)情況，并檢測(cè)各組堿性磷酸酶(ALP)的活性。 (3)體外培養(yǎng)BMP2與BMP7聯(lián)合基因修飾的ADSCs，并種植于β-TCP，進(jìn)行體外復(fù)合培養(yǎng)。使用Picogreen染料定量細(xì)胞中的雙鏈DNA，監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖過(guò)程。采用ALP定量檢測(cè)細(xì)胞在材料內(nèi)表達(dá)ALP的情況。并通過(guò)茜素紅染色、熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞與支架材料復(fù)合物的成骨活性。 (4)建立大鼠股骨缺損模型，按分組將細(xì)胞與支架材料復(fù)合物回植于股骨缺損處，回植后2、4、6周時(shí)X光拍照，同時(shí)組織學(xué)觀察體內(nèi)成骨情況。 結(jié)果： (1)分離的大鼠ADSCs在體外具有很強(qiáng)的增殖能力，表面抗原CD44、CD29表達(dá)呈陽(yáng)性，CD45、CD34、CD11b表達(dá)呈陰性，并具有向成骨和成脂細(xì)胞分化潛能。 (2)慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中BMP2和BMP7基因可以高效穩(wěn)定表達(dá)。骨鈣素(OCN)和Ⅰ型膠原的表達(dá)明顯升高，并且聯(lián)合轉(zhuǎn)染組最高。聯(lián)合轉(zhuǎn)染組的ALP活性也明顯高于單轉(zhuǎn)組。 (3) ADSCs經(jīng)BMP基因修飾后，雙鏈DNA定量分析發(fā)現(xiàn)各組細(xì)胞在支架材料上生長(zhǎng)增殖良好。細(xì)胞接種到支架材料14天后，雙基因修飾組的ALP活性、鈣化以及ALP、OPN、OC基因表達(dá)均明顯高于單基因修飾組。 (4)裸鼠實(shí)驗(yàn)中，X光和組織學(xué)檢測(cè)顯示，BMP2和BMP7雙基因修飾組及單基因修飾組都有新骨形成，但雙基因修飾組的成骨面積多于單基因修飾組(P0.01)。 結(jié)論： 通過(guò)慢病毒載體系統(tǒng)進(jìn)行雙基因轉(zhuǎn)染的大鼠脂肪干細(xì)胞（ADSCs）復(fù)合支架材料β-TCP體外構(gòu)建組織工程骨及體內(nèi)成骨的實(shí)驗(yàn)研究，我們證實(shí)利用慢病毒載體系統(tǒng)可以實(shí)現(xiàn)ADSCs穩(wěn)定長(zhǎng)期共表達(dá)hBMP2及hBMP7基因。此外，BMP2和BMP7雙基因共表達(dá)比單基因表達(dá)能夠更有效促進(jìn)組織工程化骨的成骨效果。
[Abstract]:Background:
Repair of bone defect is one of the difficult problems to be solved in clinical department of orthopedics. In recent years, with the development of tissue engineering, application of tissue engineered bone to repair bone defects has become a research hotspot. The bone regeneration is a complex process of interaction of many factors, in this process, many growth factors play an important role among them, bone morphogenetic protein (Bone Morphogenetic, Proteins, BMPs) and osteogenic induction is closely related to the.BMP family members, BMP2 has the highest osteoinductive activity, at the same time, studies show that BMP7 can promote the proliferation of osteoblasts and new bone formation. Therefore, we hypothesized that CO expression of BMP2 and BMP7 may be more conducive to ADSCs cells into bone cells and transformed cell proliferation in vivo, so as to better promote bone tissue growth and healing.
Objective:
The feasibility of constructing tissue-engineered bone was studied by using synthetic beta -TCP calcium phosphate ceramic as scaffold material and adipose derived stem cells (ADSCs) combined with BMP2 and BMP7 gene modified genetically modified rat adipose derived stem cells.
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本文編號(hào)：1595872