本文選題：HIF-1α　切入點：BMSCs　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù),利用HIF-1α基因修飾SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs),體外實驗檢測目的基因調(diào)控BMSCs成骨和成血管向分化的作用,并構(gòu)建HIF-1α介導(dǎo)BMSCs復(fù)合PLGA支架材料血管化組織工程骨,通過觀察其在大鼠顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損中的修復(fù)效果,探索目的基因雙重調(diào)控作用,為將來臨床上修復(fù)骨缺損提供部分實驗依據(jù),奠定一定的理論基礎(chǔ)。方法體外分離和培養(yǎng)SD大鼠BMSCs,構(gòu)建慢病毒載體Lenti-HIF-1α,并用該載體轉(zhuǎn)染BMSCs,在轉(zhuǎn)染后的1~7d鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染效率和細(xì)胞生長狀態(tài),確定該載體最佳轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)MOI值;運(yùn)用MTT比色分析法檢測HIF-1α對BMSCs增殖的影響。在Lenti-HIF-1α轉(zhuǎn)染BMSCs的第1天、第4天、第7天、第14天和第21天提取m RNA,利用RT-PCR檢測關(guān)鍵性成血管因子VEGF和成骨因子OCN的表達(dá)。將轉(zhuǎn)染目的基因HIF-1α的BMSCs與支架材料PLGA共培養(yǎng)構(gòu)建復(fù)合體,掃描電鏡觀察BMSCs和轉(zhuǎn)染目的基因HIF-1α后的BMSCs在PLGA支架材料上的附著生長情況及材料的形態(tài)。并用上述構(gòu)建的細(xì)胞與支架材料共培養(yǎng)復(fù)合體修復(fù)SD大鼠顱骨雙側(cè)直徑5mm的標(biāo)準(zhǔn)骨缺損(n=18),隨機(jī)分為三組:實驗組植入HIF-1α-BMSCs/PLGA復(fù)合體(n=6),對照組植入BMSCs/PLGA復(fù)合體(n=6),材料組僅植入PLGA支架材料(n=6)。術(shù)后8周處死大鼠并取材,分別行大體觀察、X線片檢查和HE染色觀察大鼠顱骨缺損區(qū)骨修復(fù)效果。收集的實驗數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,使用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析,當(dāng)P0.05時,為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果普通顯微鏡下可見BMSCs呈貼壁生長,細(xì)胞形態(tài)呈長梭形或多角形,旋渦狀生長。當(dāng)感染復(fù)數(shù)(MOI)=12時,Lenti-HIF-1α轉(zhuǎn)染BMSCs的效率最高,并且在病毒轉(zhuǎn)染后的第7天,鏡下觀察病毒轉(zhuǎn)染效率達(dá)80%以上,MTT比色分析法檢測結(jié)果顯示HIF-1α對細(xì)胞的增殖無顯著影響(P0.05);RT-PCR結(jié)果顯示,與單純BMSCs相比,Lenti-HIF-1α轉(zhuǎn)染BMSCs后的第4天、第7天、第14天和第21天,可明顯促進(jìn)成血管因子VEGF的表達(dá),目的基因轉(zhuǎn)染后的第7天、第14天和第21天,能明顯促進(jìn)成骨因子OCN的表達(dá)(P0.05)。掃描電鏡結(jié)果顯示單純BMSCs及轉(zhuǎn)染目的基因HIF-1α后的BMSCs均可于支架材料PLGA的表面附著生長,且PLGA支架材料呈三維立體多孔狀結(jié)構(gòu)。SD大鼠顱骨標(biāo)準(zhǔn)骨缺損的修復(fù)效果通過大體觀察、X線片檢查和HE染色均顯示實驗組缺損區(qū)新骨形成量明顯多于對照組及材料組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論以慢病毒為載體的HIF-1α能夠成功轉(zhuǎn)染至BMSCs中,并持續(xù)上調(diào)BMSCs中成骨、成血管因子的表達(dá)。體外實驗證明HIF-1α能夠顯著促進(jìn)BMSCs向成骨和成血管方向分化。體內(nèi)研究表明HIF-1α能夠介導(dǎo)BMSCs促進(jìn)骨組織形成,PLGA是理想的支架材料之一,用其構(gòu)建的血管化工程骨能夠有效修復(fù)骨缺損。
[Abstract]:Objective to investigate the effect of HIF-1 偽 gene on the regulation of BMSCs osteogenesis and angiogenesis of bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) of SD rats by gene transfection in vitro. The vascularized tissue engineering bone of HIF-1 偽 -mediated BMSCs composite PLGA scaffold was constructed. By observing the repair effect of HIF-1 偽 -mediated BMSCs scaffold in the standard bone defect of rat skull, the double regulation of target gene was explored. To provide some experimental evidence for clinical repair of bone defect in the future. Methods Sprague-Dawley rats were isolated and cultured in vitro, and lentivirus vector Lenti-HIF-1 偽 was constructed. The vector was transfected with BMSCs. The transfection efficiency and cell growth state of the vector were observed under the microscope for 1 ~ 7 days after transfection, and the optimal complex MOI value of the vector was determined. MTT colorimetric assay was used to detect the effect of HIF-1 偽 on the proliferation of BMSCs. On day 1, day 4 and day 7 of Lenti-HIF-1 偽 transfection of BMSCs, HIF-1 偽 was used to detect the proliferation of BMSCs. On the 14th and 21st days, RT-PCR was used to detect the expression of VEGF and OCN. The BMSCs transfected with the target gene HIF-1 偽 was co-cultured with the scaffold PLGA to construct the complex. The growth and morphology of BMSCs and BMSCs after transfection of target gene HIF-1 偽 on PLGA scaffold were observed by scanning electron microscope. The bilateral diameter of skull of SD rats was repaired with the cell and scaffold co-culture complex. A 5mm standard bone defect was randomly divided into three groups: the experimental group was implanted with HIF-1 偽 -BMSCs / PLGA complex, the control group was implanted with the BMSCs/PLGA complex, and the control group was only implanted with the PLGA scaffold material. The rats were sacrificed 8 weeks after operation. The effect of bone repair in the skull defect of rats was observed by gross X-ray examination and HE staining. The collected experimental data were expressed as mean 鹵standard deviation, and the variance analysis was carried out by SPSS 16.0 statistical software. Results under ordinary microscope, BMSCs was observed to be adherent growth, cell morphology was fusiform or polygonal, swirling growth. When infected with plural moi = 12:00 Lenti-HIF-1 偽, the efficiency of transfection of BMSCs was the highest, and on the 7th day after virus transfection, the effect of Lenti-HIF-1 偽 transfection was the highest. The results of MTT colorimetric assay showed that HIF-1 偽 had no significant effect on cell proliferation. The results of RT-PCR showed that HIF-1 偽 had no significant effect on cell proliferation. Compared with BMSCs alone, BMSCs was transfected on the 4th, 7th, 14th and 21st day after transfection. The expression of angiogenic factor VEGF was significantly increased on day 7, day 14 and day 21 after transfection. The results of scanning electron microscope showed that both BMSCs and BMSCs after transfection of target gene HIF-1 偽 could grow on the surface of the scaffold PLGA. The repair effect of standard bone defect of PLGA scaffold was three-dimensional and porous. The results of X-ray examination and HE staining showed that the amount of new bone formation in the experimental group was significantly higher than that in the control group and the material group. Conclusion the lentivirus vector HIF-1 偽 can be successfully transfected into BMSCs and continuously up-regulate osteogenesis in BMSCs. In vitro, HIF-1 偽 can significantly promote the differentiation of BMSCs into osteogenesis and vascularization. In vivo studies show that HIF-1 偽 can mediate BMSCs to promote the formation of bone tissue. HIF-1 偽 is one of the ideal scaffolds. The vascularized bone can be used to repair the bone defect effectively.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R318.08

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本文編號：1580335