本文選題：豬尸肝　切入點：去細胞化支架　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景:肝臟是人體最大、最重要的腺器官,幾乎參與著體內(nèi)的一切新陳代謝活動。另外,其特有的解毒和吞噬免疫功能使其成為人體最重要的屏障器官。近二十年來,肝臟疾病對人類健康的危害日益加深,每年有逾數(shù)萬例患者會患上該病,終末期肝衰竭患者通常伴隨著嚴重的代謝紊亂,神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,最終導致多器官功能衰竭。我國是世界上病毒性肝炎和肝癌的高發(fā)國家,全球每年死于肝癌的病人多達百萬于人,我國約占去了一半。至今為止,原位移植仍然是目前治療終末期肝臟衰竭的主要治療方法。然而,移植供肝的需求量遠遠地超過了目前可用的供體肝臟的數(shù)量。在此背景下,一些新方法如利用組織工程和再生醫(yī)學等來實現(xiàn)組織、器官的功能替代成為緩解移植肝臟供需矛盾的新選擇。盡管已有實驗室報道證實在組織和器官結(jié)構(gòu)的體外重建研究上取得了一些進展,但是由于以往體外構(gòu)建的組織器官無法具備完整的血管網(wǎng)絡,因而無法進行完善的營養(yǎng)及氣體交換,更無法實現(xiàn)器官的移植。近些年,隨著組織去細胞技術(shù)的發(fā)展,特別是全器官脫細胞支架的出現(xiàn)為制備新型組織、器官提供了可能。這些支架保留了組織中天然的細胞外基質(zhì)(ECM)成分,保留了組織器官中的微架構(gòu),特別是保留了完整的血管系統(tǒng),從而為實現(xiàn)組織器官的物質(zhì)交換、與受體循環(huán)系統(tǒng)的吻合提供可能。目前,利用去細胞技術(shù)開發(fā)的人工器官研究已經(jīng)涉及到心臟,肝臟,肺,腎等多種器官,部分實驗結(jié)果令人鼓舞。然而,由于多數(shù)質(zhì)厚的實質(zhì)器官組結(jié)構(gòu)復雜,全器官特別是大動物肝臟的脫細胞過程十分復雜。豬肝與人體肝臟大小、體型相當,易于獲取,從臨床意義上講是最適合體外構(gòu)建組織工程肝臟的支架材料。然而,由于豬肝組織厚實,且去細胞化灌注過程中肝內(nèi)組織結(jié)構(gòu)變化復雜,去細胞試劑及灌注速度的選擇都將影響著去細胞化的效率。目前關于豬去細胞化肝臟的制備方法還無統(tǒng)一意見,分析既往文獻報道我們不難發(fā)現(xiàn),都需要大量的試劑、長時間的灌注來獲取,既消耗實驗材料,且長時間的灌注又可能將肝臟支架上有用的物質(zhì)如sGAG等沖洗下來,降低支架的“活性”。因此尋找最優(yōu)的大動物去細胞化方法非常必要。另一方面,肝臟結(jié)構(gòu)、功能極其復雜,重建十分困難,近年來研究進展緩慢,如何進一步拓展去細胞支架的應用范圍成為近些年的研究熱點。眾所周知,肝細胞在脫離體內(nèi)生長環(huán)境后其功能迅速降低,包括細胞合成、分泌白蛋白、尿素等物質(zhì)的功能降低;細胞轉(zhuǎn)化、代謝藥物、血氨及游離膽紅素代謝所需要的依賴P450的細胞色素酶系列、谷氨酰胺合成酶(GS)、葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT)及谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)等酶類的合成、活性降低,其它如氨基轉(zhuǎn)移酶ALT,AST,酪氨酸轉(zhuǎn)移酶(TAT)以及乳酸脫氫酶(LDH),還有和糖類代謝相關的G-6-P等酶類也會受到不同程度的影響。因此,如何模擬肝細胞生長微環(huán)境是體外培養(yǎng)、擴增肝臟細胞的重點。去細胞化組織、器官支架材料保留了動物組織、器官中的大部分細胞外基質(zhì)成分,其中包括器官特異性的膠原蛋白組合、糖胺聚糖(S-GAG)及各種糖蛋白等成分。因此,可以說去細胞化組織、器官支架材料是理論上最適合細胞生長的生物支架材料。近年來,去細胞化肝臟支架材料被越來越多的應用于肝臟組織工程研究過程當中。許多科學家在掌握了肝臟去細胞化技術(shù)質(zhì)后都爭先嘗試體外利用去細胞肝臟支架進行肝臟組織重建的研究工作。近幾年陸續(xù)有報道證實成功在去細胞化肝臟支架上種植、培養(yǎng)肝細胞、內(nèi)皮細胞及干細胞等細胞材料,甚至將“再細胞化”的“組織工程肝臟”移植到體內(nèi)救治肝衰動物模型。然而,由于肝臟管道空間結(jié)構(gòu)極其復雜、精細,使得肝細胞、肝竇內(nèi)皮細胞等在“裸露”的膠原纖維支架上更加容易受到流體剪切力等有害因素的影響,再加上這些細胞體外培養(yǎng)過程中容易發(fā)生“去分化”,此時,其形態(tài)、功能都表現(xiàn)為“退化”明顯,因此有關利用去細胞化肝臟支架實施肝臟組織的重建研究進展十分緩慢。為了進一步拓展去細胞化支架的研究應用范圍,我們擬通將去細胞化肝臟支架制備成一定“硬度”及形態(tài)的可溶性基質(zhì)樣物質(zhì)。然后通過檢測其中支架中各種膠原成分的比例及生物活性物質(zhì)的保留程度,與I型膠原、心臟去細胞支架基質(zhì)成分進行比較,觀察其特異性,最后通過細胞實驗證實其對肝細胞的增殖、分化等功能的特異性影響。遠期通過加工、改造制備成不同三維結(jié)構(gòu)的膠樣產(chǎn)品,最后與細胞相混合培養(yǎng),選擇合適的微創(chuàng)植入方式救治肝衰動物模型。第一章豬去細胞化肝臟支架制備及成分鑒定目的:通過對豬去細胞化肝臟支架制備方案進行改進,得到優(yōu)化的去細胞化支架制備流程,檢驗該生物支架的一般特性,為進一步利用大動物去細胞化肝臟支架進行體外研究提供可靠的材料來源。方法:以豬尸體肝臟作為研究對象,以SDS為去垢劑,針對尸肝的特點引入尿激酶、EDTA及流速等關鍵點進行去細胞化肝臟制備方法的優(yōu)化。肝臟初步處理完成后,經(jīng)肝臟門靜脈插入19號硅膠管,連接蠕動泵。首先利用500mml含100000IU/L尿激酶的生理鹽水進行灌洗,灌洗速度為10ml/min,然后將肝臟放入-80℃冰箱,存放時間需超過48h。繼續(xù)經(jīng)門靜脈硅膠管灌注3000ml灌注液Ⅰ(含0.2g/L EDTA的生理鹽水),灌注速度為40ml/min;灌注約15L灌注液Ⅱ (含5g/L SDS的生理鹽水),灌注速度20ml/min;灌注200ml灌注液Ⅲ (含0. O1g/L DNase的生理鹽水),并于4℃保存2h;灌注200ml灌注液Ⅳ (含有濃度為0. 01%的過氧乙酸),并于4℃保存3h。最后緩慢灌注含有1%青-鏈霉素的0.9%NaCL溶液進行沖洗,用量10L,灌注用時約8h。最后使用HE染色、PAS染色、Masson染色及電鏡檢查脫細胞效果,DNA分析試劑盒測定支架上DNA殘余量,使用SDS-PAGE、LC-MS/MS測定支架上膠原等成分的保留狀況,使用Blyscan分析試劑盒測定支架上S-GAG含量。結(jié)果:本實驗灌注豬肝臟25個,成功20個,成功率80%。經(jīng)門靜脈注射泛影葡胺造影劑后可見去細胞肝臟支架內(nèi)門靜脈管道逐級顯現(xiàn),未見明顯的造影劑滲漏情況。H-E、Masson's染色證實支架上未見明顯的細胞結(jié)構(gòu)殘留,可見纖維樣結(jié)構(gòu)完整保存,大量膠原纖維存在,并可見膠原纖維圍成管道樣結(jié)構(gòu)。DNA濃度測定結(jié)果顯示凍干豬去細胞肝臟支架上殘余量為7. 41 ±0. 88 ng/mg (n=3)。PAS染色可見紫紅色物質(zhì)殘余,證實組織中存在的糖原和其他多糖物質(zhì)。掃描電鏡可見大量纖維編制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及管狀結(jié)構(gòu)。免疫熒光染色檢查提示支架上包含有大量的Ⅰ、Ⅳ、彈性蛋白、層粘連蛋白及纖維連接蛋白殘余。LC-MS/MS實驗支架上除了保留支架上固有的蛋白成分,還保留了多種糖蛋白成分。sGAG試劑盒測定結(jié)果顯示凍干豬去細胞肝臟支架上殘余sGAG明顯高于凍干的豬去細胞化心臟支架上的sGAG含量(23.766± 0.423ug/mg vs 14.519± 0.328 ug/mg3,P0.05, n=3)。結(jié)論:使用尿激酶聯(lián)合化學去垢劑等灌注液制備豬尸肝去細胞化肝臟支架的方法是切實可行的。該方法可有效地去除組織中包含的細胞成分,同時可以保留支架上的細胞外基質(zhì)成分,具有良好的組織相容性好,可以作為肝臟組織工程的備選支架材料。第二章利用豬去細胞化肝臟支架制備肝細胞特異性培養(yǎng)基質(zhì)目的:肝細胞脫離體內(nèi)生長環(huán)境后其功能迅速降低。因此,體外重建肝細胞生長微環(huán)境是體外培養(yǎng)、擴增肝細胞的重點。去細胞化支架保留了組織、器官中的大部分細胞外基質(zhì)成分,包括特異性的膠原組合、S-GAG及生長因子等成分,理論上是最適合細胞生長的生物支架材料。本研究擬通過將豬去細胞化肝臟支架加工成一種肝細胞特異性培養(yǎng)基質(zhì)成分,再通過肝細胞的特意性培養(yǎng),比較其與其它組織來源的去細胞基質(zhì)及Ⅰ型膠原培養(yǎng)基質(zhì)對于肝細胞增殖及功能影響的差異性,進而證實豬肝臟去細胞化支架培養(yǎng)基質(zhì)對于肝細胞的特異性效果。方法:以豬尸肝去細胞化肝臟支架作為研究對象,以豬心臟去細胞支架及Ⅰ型膠原溶液作為對照,先后使用尿激酶溶液、SDS溶液及DNA酶等溶液對豬肝、心臟組織切片進行去細胞化處理。再經(jīng)過凍干、粉碎及Pepsin-HCl消化48h后成為膠樣基質(zhì)溶液。通過SDS-PAGE實驗及sGAG測定驗證豬肝臟基質(zhì)、心臟基質(zhì)及Ⅰ型膠原之間的成分差異,通過圓二色光譜實驗驗證豬肝去細胞化基質(zhì)成分中膠原蛋白的活性。最后通過C3A細胞的特異性培養(yǎng)比較三種基質(zhì)成分在培養(yǎng)過程中對于細胞增殖、形態(tài)及功能方面的差異情況。結(jié)果:豬肝臟、心臟組織切片經(jīng)過36h處理后脫細胞完全,經(jīng)含有胃蛋白酶的稀鹽酸溶液48h后形成乳白色粘稠液體,再經(jīng)過NaOH及10PBS溶液配平后即作為細胞培養(yǎng)基質(zhì)。使用sGAG試劑盒測得去細胞化肝臟支架培養(yǎng)基質(zhì)中含有sGAG含量明顯高于去細胞化心臟支架培養(yǎng)基質(zhì)中的含量(14.28±0.127ug/mg vs 12.373± 0.125ug/ng,P0.05,n=3)。細胞培養(yǎng)實驗結(jié)果顯示:通過AnnexinV細胞凋亡檢測實驗發(fā)現(xiàn)C3A細胞在豬去細胞化肝臟支架培養(yǎng)基質(zhì)上生長第5天時正常細胞所占到的比例高于在心臟支架基質(zhì)及Ⅰ型膠原上生長的比例;另外,無論是早期凋亡細胞數(shù)比例還是晚期凋亡細胞數(shù)比例,豬去細胞肝臟支架基質(zhì)上的都明顯低于在去細胞化豬心臟支架基質(zhì)及Ⅰ型膠原基質(zhì)上的細胞。通過Q-PCR及白蛋白、尿素的分泌情況來評價三種細胞培養(yǎng)基質(zhì)對于細胞的影響。我們發(fā)現(xiàn)從第2天到第7天,C3A細胞培養(yǎng)在去細胞化肝臟支架培養(yǎng)基質(zhì)上分泌Albumin及Urea的量明顯高于細胞在去細胞化心臟支架基質(zhì)及Ⅰ型膠原基質(zhì)上的分泌量(P0.05, n=3)。測定Albumin、G6PD及CYP3A4三種分子的細胞表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn)C3A細胞在豬去細胞化肝臟支架基質(zhì)上表達Ammbumin、G6PD及CYP3A4三種分子的水平明顯高于細胞在去細胞化心臟支架基質(zhì)及Ⅰ型膠原基質(zhì)上的表達水平(P0.05,n=3),而去細胞化心臟支架基質(zhì)及Ⅰ型膠原基質(zhì)兩者之間無明顯的差異(P0.05,n=3)。結(jié)論:使用豬肝臟去細胞化支架制備的基質(zhì)溶液保留了肝臟原始支架中大部分蛋白及多糖成分,這種基質(zhì)鋪板后用于C3A細胞的培養(yǎng),能夠促進肝腫瘤細胞系C3A細胞的增殖及功能維持。說明利用去細胞化肝臟支架制備的基質(zhì)能夠用于肝細胞的體外擴增。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08;R657.3

【參考文獻】

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1 潘明新;程遠;汪燕;何國林;胡鵬運;高毅;;去細胞化肝臟生物支架材料的制備[J];南方醫(yī)科大學學報;2011年01期

2 李德富;周玉玲;穆暢道;林煒;;超聲波對溶液中膠原蛋白聚集體和三股螺旋結(jié)構(gòu)的影響[J];皮革科學與工程;2009年05期

3 康玉占;汪艷;高毅;;脫細胞化肝臟生物衍生支架的制備及鑒定[J];中國組織工程研究與臨床康復;2009年08期

4 徐迎新,黃志強;肝組織工程研究[J];中華實驗外科雜志;2005年08期

5 康玉占;汪艷;高毅;;去細胞化技術(shù)在全肝生物支架建立中的應用[J];中華醫(yī)學雜志;2009年16期

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本文編號：1564661