本文選題：胰島移植　切入點：β細胞　出處：《浙江大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：近年來,超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIO)或超小超順磁性氧化鐵納米顆粒(USPIO)良好的生物相容性及多能性得到廣大學者的普遍認同,被越來越多地應(yīng)用于標記細胞或者腫瘤,尤其是在進行活體內(nèi)無創(chuàng)監(jiān)測示蹤方面。但自從美國食品藥品管理局(FDA)批準的第一批商用SPIO產(chǎn)品Feridex?和Resovist?分別在2008年和2009年底停產(chǎn)以來,一直未有一種合適的能夠在臨床應(yīng)用的SPIO替代產(chǎn)品出現(xiàn)。在本研究中,我們研發(fā)了一種簡便的、以無毒性的水合無機鐵鹽作為納米材料鐵核心的前體替代過往相對劇毒的乙酰丙酮鐵的合成工藝。并在此基礎(chǔ)上,進一步用兩親性聚合物--羧基化的聚氧乙烯月桂醚(OE-PEG-COOH)對油性環(huán)境下合成的鐵核心進行包被,制備了具有良好水溶性的USPIO納米顆粒,最后再用Bcl-2等單抗對其表面進行功能化。進一步實驗證實,這種新型的納米材料能夠有效的被β細胞內(nèi)吞,并在相對低鐵濃度下對原代胰島細胞進行有效標記。我們通過商用產(chǎn)品FeraSpin S對這種新型納米材料進行了生物相容性以及細胞毒性的對比實驗研究,并對其安全劑量范圍進行了初步測定。進一步的結(jié)果證實,這種新型納米材料能夠有效地對體內(nèi)的移植胰島細胞進行標記示蹤,并在臨床3.0T MRI場強下清晰顯影。后續(xù)的普魯士藍染色實驗以及免疫組化實驗亦對納米材料能夠有效標記體內(nèi)胰島細胞予以進一步證實。此外,值得一提的是,基于本合成路線,我們可以將末端Bcl-2功能化單抗替換成任意其他特異性的靶標分子,合成新型的其他特異性USPIO探針,提高標記特異性,例如Exendin-4-USPIO。以上結(jié)果均提示這種新型的功能化USPIO具有標記示蹤胰島細胞或其他細胞的良好應(yīng)用前景。 第一部分Bcl-2功能化USPIO的制備及其表征 目的：自行研制無毒性兩親性聚合物表面修飾的USPIO,修飾親水末端基團進行Bcl-2單抗連接,并對制備的磁納米顆粒的結(jié)構(gòu)、形貌和理化性狀進行表征。 方法：油性條件下采用無毒水合鐵鹽作為前體制備USPIO鐵核心,然后通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法對其進行兩親性聚合物的包被增加水溶性。應(yīng)用酸化氧化法對親水端末端OH基團改性為COOH基團,后續(xù)應(yīng)用NHS/EDC法與Bcl-2單抗相連制備功能化USPIO。并進一步對制備的USPIO、Bcl-2-USPIO通過等離子發(fā)射光譜(ICP)、透射電子顯微鏡(TEM)、納米激光粒度儀(DLS)、振動樣品磁強計(MPMS)和磁共振成像系統(tǒng)(MR scanner)等方法對其理化性狀進行研究。 結(jié)果：USPIO呈黑褐色,長時間放置不產(chǎn)生團聚。TEM掃描提示USPIO顆粒核心直徑約為4～10nm,分布集中,大小均一,性質(zhì)穩(wěn)定,分散性好。經(jīng)兩親性聚合物包被后,納米激光粒度儀分析結(jié)果提示整體粒徑平均尺寸為28nm。C13質(zhì)譜測試,證實兩親性聚合物的羥基端成功改性為羧基,在163ppm處出現(xiàn)明顯峰值。制備的USPIO在室溫(300K)外磁場為2T時的磁滯回線提示制備的USPIO的飽和磁化強度為38emu/g,與商用產(chǎn)品Feridex41emu/g相當。MRI顯示USPIO可以明顯縮短T1和T2弛豫時間,T2信號強度與樣品的Fe濃度正相關(guān)。 結(jié)論：成功制備出具有高分散性、強磁性、粒徑均勻的USPIO,3.0-T MRI顯示USPIO具備良好的超順磁性。 第二部分PEG-USPIO標記胰島細胞系INS-1、beta-TC-6的細胞 生物學研究 目的：研究自制的USPIO體外標記胰島細胞系的效率、以及對細胞活力和功能的影響,為后續(xù)胰島移植MRI活體示蹤奠定基礎(chǔ)。 方法：培養(yǎng)胰島細胞系INS-1以及Beta-TC-6,使用USPIO分別標記。采用普魯士蘭染色和細胞內(nèi)鐵濃度測定等方法觀察被標記細胞內(nèi)鐵顆粒情況。利用梯度濃度USPIO標記INS-1細胞,普魯士蘭染色檢測其標記效率。采用四唑鹽(MTT)比色試驗檢測USPIO標記的INS-1細胞活力。應(yīng)用流式細胞儀熒光檢測標記后細胞的凋亡水平。采用葡萄糖刺激胰島素釋放試驗對標記后Beta-TC-6細胞的胰島素分泌功能進行評估。 結(jié)果：細胞內(nèi)鐵染色：普魯士藍染色顯示USPIO標記的INS-1細胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)細小的藍色鐵顆粒。標記效率的檢測：體外MRI掃描和普魯士藍染色提示,不同鐵濃度USPIO和FeraSpin S分別標記2105INS-1細胞24h, MRI掃描T2信號隨標記鐵濃度升高而降低,細胞質(zhì)內(nèi)的藍色鐵顆粒也相應(yīng)增加。在相同鐵濃度下作用24h, USPIO較FeraSpin S對INS-1細胞的標記效率更高。細胞形態(tài)學觀察：倒置相差顯微鏡下USPIO標記組、FeraSpin S標記組和未標記組INS-1細胞之間,細胞形態(tài)無明顯差異。USPIO對細胞活力的影響：MTT結(jié)果顯示,USPIO和FeraSpinS在0-50μg Fe/mL濃度以下標記INS-1細胞24h,細胞活力在超過30μg Fe/mL濃度后逐漸降低。USPIO對細胞增殖的影響：USPIO和FeraSpin S以0-50μg Fe/mL濃度標記INS-1細胞24h,細胞生長能力在超過30μg Fe/mL濃度后逐漸降低。USPIO對細胞早期凋亡水平的影響：流式細胞儀檢測顯示,USPIO以0-50μg Fe/mL濃度標記INS-1細胞24h,細胞凋亡／死亡在超過30μg Fe/mL濃度后逐漸增加。USPIO對細胞功能的影響：葡萄糖刺激胰島素釋放試驗結(jié)果顯示,USPIO以0-50μg Fe/mL濃度標記24h, Beta-TC-6細胞胰島素釋放功能在超過30μg Fe/mL濃度后明顯降低。 結(jié)論：制備的USPIO具有良好的生物相容性和超順磁性,能夠有效標記INS-1以及Beta-TC-6細胞,對細胞的活性和功能在未超過30μg Fe/mL濃度的情況下沒有明顯影響,在標記細胞的MRI體外掃描中表現(xiàn)出很強的磁信號。 第三部分Bcl-2功能化USPIO標記小鼠原代胰島細胞MRI活體 示蹤研究 目的：在體外應(yīng)用USPIO對小鼠原代胰島細胞進行標記,建立USPIO標記小鼠胰島細胞同種異體腎包膜下移植模型,應(yīng)用3.0-T臨床磁共振成像系統(tǒng)動物線圈活體示蹤USPIO標記小鼠胰島細胞。 方法：將制備的USPIO,分別取0,1.25,2.5,5,10,20,30,40,60,80μg Fe/mL不同濃度,進行MRI體外掃描,觀察信號變化。分離純化150個C57BL/6小鼠胰島,用制備的PEG-USPIO標記后,進行C57BL/6小鼠同種異體腎包膜下移植,術(shù)后第1,8,15,21d對移植物進行MRI活體示蹤。將移植模型腎臟進行石蠟切片,胰島素免疫組織化學染色和普魯士藍染色觀察。 結(jié)果：通過USPIO以0,1.25,2.5,5,10,20,30,40,60,80μg Fe/mL濃度數(shù)量梯度的MRI體外掃描,確定MRI掃描的磁強回歸線性參數(shù)。USPIO10和30μgFe/mL濃度標記的150個C57BL/6小鼠原代胰島同種異體腎包膜下移植,MRI活體示蹤可以觀測到理想的磁信號,時間可以持續(xù)21d,MRI信號強度隨移植后時間延長而逐漸減弱。移植模型腎石蠟切片行胰島素免疫組化/普魯士藍雙染色,證實腎包膜下USPIO標記的胰島移植物存在及其被USPIO特異性標記。 結(jié)論：制備的USPIO可以有效標記小鼠胰島細胞系INS-1及Beta-TC-6和原代胰島,并通過3.0-T臨床磁共振成像系統(tǒng)動物線圈進行同種異體腎包膜下移植MRI活體示蹤。 第四部分Exendin-4功能化USPIO靶向胰島細胞MRI活體示蹤研究 目的：嘗試Exendin-4-USPIO對胰島β細胞進行特異性標記,體外實驗驗證其標記有效性,體內(nèi)應(yīng)用3.0-T臨床磁共振成像系統(tǒng)動物線圈活體示蹤小鼠胰島素瘤。 方法：更換USPIO的靶向探針為exendin-4,常規(guī)體外驗證其標記胰島細胞有效性及細胞毒性。通過全身各器官病理切片及普魯士藍染色驗證USPIO的體內(nèi)分布情況。通過exendin-4與量子點的連接,熒光成像驗證exendin-4的靶向性。構(gòu)建INS-1種植瘤模型小鼠,通過尾靜脈注入exendin-4-USPIO24小時后,進行MRI活體示蹤。將移植模型腎臟進行石蠟切片,胰島素免疫組織化學染色和普魯士藍染色觀察驗證USPIO標記情況。 結(jié)果：新制備的exendin-4-USPIO具有良好的生物相容性,未見明顯細胞毒性。病理切片結(jié)果顯示,無exendin-4修飾的USPIO積聚于肝、腎、脾、肺等組織,但并不積聚于胰腺的內(nèi)、外分泌腺組織中；而exendin-4修飾的USPIO不僅在肝、脾等網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中非特異性聚集外,還在胰腺中存在,并在胰島中特異聚集。USPIO尾靜脈注入負瘤小鼠體內(nèi)24小時后,MRI活體示蹤可以觀測到胰島素瘤體部位明顯的磁信號。將瘤體行石蠟切片、胰島素免疫組化／普魯士藍雙染色,證實其被exendin-4-USPIO特異性標記。 結(jié)論：制備的exendin-4-USPIO可以有效標記小鼠胰島細胞系和原代胰島,并能夠?qū)π∈笠葝u素瘤進行MRI活體特異性示蹤。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08;R735.9

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 劉再毅;王瑛;王廣誼;李曉紅;李晏;粱長虹;;超順磁性氧化鐵標記脂肪干細胞移植入大鼠心臟后的活體磁共振示蹤成像[J];中國醫(yī)學科學院學報;2009年02期

2 倪萍;陳自謙;;胰島細胞移植磁共振掃描活體示蹤的序列優(yōu)化[J];中國組織工程研究與臨床康復;2011年18期

3 ;[J];;年期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關(guān)博士學位論文 前2條

1 楊斌;功能化超小超順磁性納米鐵顆粒（USPIO）的合成及其在小鼠胰島細胞移植活體示蹤的應(yīng)用[D];浙江大學;2014年

2 楊俊杰;基因修飾在提高脂肪來源干細胞移植治療心梗療效和指導體內(nèi)示蹤中的應(yīng)用研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2012年

相關(guān)碩士學位論文 前3條

1 辛磊;低濃度SPIO標記兔BMSCs的體外MR成像及RIRI兔體內(nèi)移植的活體示蹤研究[D];山西醫(yī)科大學;2009年

2 林建浩;乳鼠雪旺氏細胞Sinerem體外標記和磁共振成像的實驗研究[D];南方醫(yī)科大學;2009年

3 趙士宇;磁標記骨髓間充質(zhì)干細胞對大鼠肝切除術(shù)后肝再生作用的實驗研究[D];大連醫(yī)科大學;2013年

，

本文編號：1560413