本文關(guān)鍵詞： 乙型肝炎病毒 丙型肝炎病毒 檢測 DNA疫苗 免疫反應(yīng) 抗體 金納米粒子 量子點(diǎn)　出處：《浙江大學(xué)》2013年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：病毒是一種導(dǎo)致全球發(fā)病率和死亡率持續(xù)升高的病原體。快速靈敏的檢測系統(tǒng)加高效的疫苗能防止病毒感染和傳播。然而目前已有的相關(guān)技術(shù)存在許多缺陷。隨著全球總?cè)丝跀?shù)量和移民數(shù)量的不斷增長,對于病毒的檢測手段和疫苗提出了更高的要求。納米材料包括了具有非常獨(dú)特和重要特性的一系列納米尺度的物質(zhì),稱為納米結(jié)構(gòu)。其中金納米結(jié)構(gòu)是研究得最多的具有獨(dú)特表面等離子體特性的一類納米結(jié)構(gòu)。由于它們出色的生物相容性和穩(wěn)定性,一些金納米結(jié)構(gòu)在生物醫(yī)藥中的應(yīng)用潛能正在被開發(fā),它們是病毒檢測和疫苗研發(fā)中大有希望的候選材料。本論文主要通過下列兩方面的研究來評(píng)估其在病毒檢測和疫苗研發(fā)中的作用： 1.聯(lián)合納米組件和等離子體的共振傳感器技術(shù)用于檢測乙型肝炎病毒。這一技術(shù)主要是建立了一種新型的基于聯(lián)合納米組件和等離子體的共振傳感器,共振傳感器主要由一個(gè)核心元件和多個(gè)帽狀生物納米配體組成。每個(gè)帽狀配體是由金納米粒子和乙肝病毒表面抗原preS2的一段短肽偶聯(lián)而成；而核心元件是由綠色(3nm)量子點(diǎn)上結(jié)合多個(gè)能特異性識(shí)別preS2短肽的Fab片段而組成的。由于核心元件上的Fab片段可以特異性結(jié)合帽狀配體上的preS2短肽,兩者形成了核心元件-帽狀配體納米組件復(fù)合體。當(dāng)反應(yīng)體系中有乙肝病毒存在時(shí),核心元件上的Fab片段會(huì)競爭性與乙肝病毒preS2短肽結(jié)合,從而破壞核心元件-帽狀配體納米組件復(fù)合體的形成。用多種技術(shù)(如紫外可見吸收光譜術(shù)、透射電子顯微鏡術(shù)、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)、Zeta電位分析法、傅里葉變換紅外光譜術(shù)、能量色散x射線分析術(shù)、熒光光譜術(shù)、瓊脂糖凝膠電泳)均證實(shí)了核心元件、帽狀配體及其上偶聯(lián)的傳感分子以正確的形式(如單獨(dú)存在或形成復(fù)合體)和結(jié)構(gòu)存在。通過比較反應(yīng)體系中加入的乙肝病毒表面抗原和完整的乙肝病毒顆粒,評(píng)估了核心元件-帽狀配體納米組件復(fù)合體甩于檢測乙肝病毒的靈敏度和特異性,也進(jìn)一步分析了納米組件復(fù)合體的動(dòng)力學(xué)特征。結(jié)果表明,我們首創(chuàng)的聯(lián)合納米組件和等離子體的共振傳感器技術(shù)是一種快速和高靈敏度的病毒檢測技術(shù),可以檢測到低至1-50個(gè)病毒粒子/微升(即10-8摩爾/升)的水平。 2.納米等離子增強(qiáng)DNA疫苗遞送效率用于預(yù)防丙型肝炎病毒。該方法研制了一種新型的基于納米技術(shù),提高肌注DNA疫苗的遞送效率,用于預(yù)防丙型肝炎病毒。這種新型的遞送系統(tǒng)通過在遞送DNA疫苗的鄰近部位局部注射金納米結(jié)構(gòu),并施加幾個(gè)時(shí)間控制電脈沖而達(dá)成。我們制備了兩種特異性針對丙型肝炎病毒的DNA疫苗質(zhì)粒,分別稱為pVAX1核心與pVAX1-NS3,另又制備了不同大小(5、50與100nm)的金納米結(jié)構(gòu)。上述制備物的理化特性用紫外可見吸收光譜術(shù)、透射電子顯微鏡術(shù)、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)、Zeta電位分析法、傅里葉變換紅外光譜術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳等技術(shù)進(jìn)行了分析驗(yàn)證。對所開發(fā)的單一丙型肝炎病毒DNA質(zhì)粒及其組合分別進(jìn)行了測試。另一方面,在不同的小鼠組測試了金納米結(jié)構(gòu)與pVAX1核心聯(lián)合給藥的效果。結(jié)果清楚地表明金納米粒子即使在很低濃度時(shí)也具有提高試驗(yàn)動(dòng)物免疫反應(yīng)、增強(qiáng)特異性抗體形成的能力。納米顆粒的大小對特異性抗體形成的水平影響甚微,而對細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)卻有顯著的影響。表面負(fù)電荷能顯著影響金納米粒子增強(qiáng)pVAX1核心質(zhì)粒DNA疫苗遞送和響應(yīng)的效率。同時(shí),運(yùn)用透射電子顯微鏡和HE染色技術(shù)對肌肉組織中注射的金納米粒子進(jìn)行了檢測,證實(shí)金納米粒子的確進(jìn)入了肌細(xì)胞,并導(dǎo)致了持續(xù)性的組織溶解和炎癥。上述結(jié)果提示,我們的聯(lián)合給藥方案中金納米粒子之所以能提高機(jī)體的免疫反應(yīng),一方面可能由于增加了對DNA疫苗的攝入,另一方面可能因?yàn)檎心剂烁嗝庖呒?xì)胞到注射部位。
[Abstract]:The virus is a cause of morbidity and mortality worldwide continues to rise. The pathogen detection system of rapid and sensitive and efficient vaccine can prevent the virus infection and spread. However, there are many defects in the current existing technology. With the global population and the growing number of immigrants, for the virus detection and vaccine forward high requirements. Nano materials include a series of nanometer scale has a very unique and important characteristics of the material, called nano structure. The gold nano structure is a kind of nano structure has unique surface plasmon characteristics most. Due to their excellent biocompatibility and biological stability, some potential applications of gold nanostructures in biological medicine is being developed, they are the candidate materials for virus detection and vaccine development in great hope. This thesis mainly through the following two aspects Research to assess its role in virus detection and vaccine development:
1. sensor resonance technology and nano assembly and plasma for the detection of hepatitis B virus. This technology is mainly a kind of resonance sensor and nano assembly and plasma based on the model established, resonance sensor is mainly composed of a core element and a plurality of cap shaped nano bio ligand. Each cap is composed of a ligand short peptide conjugated gold nanoparticles and hepatitis B virus surface antigen preS2 and core element is made of green; (3nm) quantum dots with a number of specific recognition of preS2 peptide fragments of Fab and composition. Because the core components on the Fab fragment can specifically bind to preS2 peptide ligands on the cap. They formed the core components - cap ligand complex. When the nano assembly of hepatitis B virus exists in the reaction system, the core component of the Fab fragment will be competitive with hepatitis B virus preS2 binding peptides, To break the core component form a cap ligand complex. Nano components with a variety of techniques (such as UV Vis absorption spectroscopy, transmission electron microscopy, dynamic light scattering, Zeta potential analysis, Fourier transform infrared spectroscopy, energy dispersive X ray fluorescence spectroscopy analysis technique, agarose gel electrophoresis) were confirmed the core element of sensor molecule cap ligand and its coupling to the correct form (such as a separate existence and form complex) structure. Through the comparison with the hepatitis B virus surface antigen in the reaction system and complete the hepatitis B virus particles and evaluate the sensitivity and specificity of core components - cap ligand complex nano assembly rejection in the detection of hepatitis B virus, further analysis the dynamic characteristics of nano composite components. The results show that the resonance sensor with nanometer components and plasma we pioneered the Device technology is a rapid and highly sensitive virus detection technique that can detect as low as 1-50 virus particles / micro liters (10-8 mole / liter).
2. nano plasma enhanced DNA vaccine delivery efficiency for the prevention of hepatitis C virus. The method developed a model based on nanotechnology, improve the delivery efficiency of intramuscular injection of DNA vaccine, for the prevention of hepatitis C virus. This new delivery system in the adjacent area by local injection of gold nanostructures to deliver DNA vaccine, and applied several time control an electrical pulse. We have prepared two kinds of plasmid DNA vaccine specific for hepatitis C virus, called pVAX1 core and pVAX1-NS3, and the other for different size were prepared (5,50 and 100nm) of gold. The physicochemical properties of the nano structure preparation by UV Vis absorption spectroscopy, transmission electron microscopy, dynamic light scattering, Zeta potential analysis, Fourier transform infrared spectroscopy and agarose gel electrophoresis were analyzed. The single type of liver development C Virus plasmid DNA and its combinations were tested. On the other hand, the gold nanostructures and pVAX1 core test in mice of different drug combination effect. The results clearly show that the gold nanoparticles can also improve the experimental animal immune response even at very low concentration, the ability to gain high specificity of antibody formation. The level of success the effect of nano particle size on specific antibody formation, and had significant influence on the cell-mediated immune response. The surface negative charge can significantly affect the efficiency of delivery of core pVAX1 plasmid DNA vaccine and the response enhancement of gold nanoparticles. At the same time, the use of transmission electron microscopy and HE staining technique of gold nanoparticles for injection in muscle tissue the test confirmed that gold nanoparticles do go into muscle cells, and the persistent tissue dissolution and inflammation. These results suggest that our combined drug In the scheme, gold nanoparticles can enhance the immune response of the body. On the one hand, it may increase the intake of DNA vaccine, on the other hand, it may recruit more immune cells to the injection site.

【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R318.08

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本文編號(hào)：1551604