本文關(guān)鍵詞： 組織工程 椎間盤 纖維環(huán) 支架 構(gòu)建 脫細胞　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2013年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：一、研究目的 椎間盤突出癥是脊柱的常見病、多發(fā)病，是引起頸肩腰背痛的主要原因。目前的治療手段以緩解癥狀為主，不能解決椎間盤的生物結(jié)構(gòu)退變等潛在問題。組織工程因能恢復(fù)天然組織的功能而成為治療椎間盤突出的理想方法。盡管大量關(guān)于髓核組織工程的研究在實驗室階段已取得了成功，但沒有纖維環(huán)的椎間盤組織工程難以取得突破。本研究擬對異體新西蘭大白兔天然椎間盤纖維環(huán)進行脫細胞處理，旨在得到具有天然纖維環(huán)細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)、解剖學(xué)形態(tài)、力學(xué)和生物功能的脫細胞支架；同時分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細胞、纖維環(huán)細胞，分別對其活性進行測定并與脫細胞纖維環(huán)支架復(fù)合培養(yǎng)，得出脫細胞纖維環(huán)支架沒有細胞毒性，支持細胞的生長、繁殖并分泌細胞外基質(zhì)，從而探索纖維環(huán)脫細胞支架作為組織工程椎間盤纖維環(huán)支架的可行性。 二、研究方法 取1月齡新西蘭大白兔，麻醉后自髂骨或股骨內(nèi)側(cè)用骨髓穿刺針抽取3-5ml骨髓，置入培養(yǎng)瓶內(nèi)，加入培養(yǎng)基以全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細胞。取下脊柱腰段，超凈臺上剔除椎體骨質(zhì)及椎間盤外周附著的軟組織，PBS液沖洗，去除椎間盤兩側(cè)椎骨及終板結(jié)構(gòu)，剔除髓核組織及AF的最外層、最內(nèi)層，眼科剪將纖維環(huán)修剪成1mm×1mm×1mm大小的組織塊，放入培養(yǎng)瓶內(nèi)進行纖維環(huán)細胞原代細胞的培養(yǎng)。3月齡新西蘭大白兔過度全麻致死后，取下脊柱腰段，剔除椎體骨質(zhì)及椎間盤外周附著的軟組織，部分去除纖維環(huán)兩側(cè)終板結(jié)構(gòu)，橫徑平均約為12mm，矢狀徑平均約為7mm，高度平均約為3mm。纖維環(huán)進行脫細胞處理，制成脫細胞纖維環(huán)支架。對脫細胞支架材料行大體、組織學(xué)、光鏡、電鏡觀察，并對支架的孔隙率、生物力學(xué)參數(shù)等進行檢測。將支架分別與骨髓間充質(zhì)干細胞、纖維環(huán)細胞復(fù)合培養(yǎng)，，將支架植入體內(nèi)，分析纖維環(huán)支架細胞毒性與組織相容性。 三、研究結(jié)果 纖維環(huán)細胞呈梭形或多角形，骨髓間充質(zhì)干細胞為梭形，兩者生長融合大70%-80%后均呈現(xiàn)旋渦狀生長。MTT法示骨髓間充質(zhì)干細胞及纖維環(huán)細胞均有較強的增殖能力，于第7d左右達到平臺期，隨后增殖甚微，呈現(xiàn)下降趨勢，纖維環(huán)細胞較骨髓間充質(zhì)干細胞下降更為明顯。纖維環(huán)脫細胞支架為乳白色，中空橢圓狀，質(zhì)地柔軟，呈三維多孔結(jié)構(gòu)。HE染色示脫細胞纖維環(huán)支架組織內(nèi)無明顯細胞成分殘留。冰凍切片Hoechst33258顯色提示脫細胞前支架內(nèi)熒光反應(yīng)明顯，脫細胞支架內(nèi)未見明顯熒光反應(yīng)，表明纖維環(huán)支架脫細胞較徹底，沒有細胞殘留。掃描電鏡及透射電鏡示纖維環(huán)支架的顯微結(jié)構(gòu)，典型的板層結(jié)構(gòu)，膠原纖維束及板層間的彈性纖維結(jié)構(gòu)排列。脫細胞后的膠原結(jié)構(gòu)更加光滑稀松，膠原纖維完整，未見明顯改變。支架內(nèi)孔隙均勻，孔隙相通�？紫堵蕿�42.86±3.41%。生物力學(xué)結(jié)果脫細胞方法對纖維環(huán)前外側(cè)的最大拉力機纖維環(huán)后部的彈性模量有一定的影響。纖維環(huán)后部最大拉力脫細胞前后最大拉力的差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，可滿足生理需求。體外復(fù)合培養(yǎng)證明骨髓間充質(zhì)干細胞及纖維環(huán)細胞在支架上增殖活躍并能產(chǎn)生大量的Ⅰ、Ⅱ型膠原。體內(nèi)種植8周后，組織學(xué)觀察顯示細胞長入纖維環(huán)外層，炎性細胞浸入內(nèi)外層纖維環(huán)之間。 四、結(jié)論 兔椎間盤纖維環(huán)支架經(jīng)脫細胞可有效的去除纖維環(huán)支架內(nèi)部細胞成分，脫細胞徹底，具有良好的孔徑、孔隙率及生物力學(xué)強度。脫細胞方法對纖維環(huán)支架膠原成分和生物力學(xué)無明顯的影響。纖維環(huán)細胞通過負壓吸附法滲入纖維環(huán)支架內(nèi)部并生長良好。支架無細胞毒性，具備良好的生物相容性。纖維環(huán)經(jīng)脫細胞處理后可作為組織工程椎間盤纖維環(huán)支架材料。
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【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 饒建偉;沈俊;全大萍;許揚濱;;三維多孔共混絲蛋白支架的性能研究[J];中國修復(fù)重建外科雜志;2009年10期

本文編號：1518000