本文關(guān)鍵詞： 細(xì)胞外基質(zhì)膠 Matrigel 人脂肪源性干細(xì)胞 創(chuàng)面愈合 細(xì)胞治療 組織工程　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:皮膚組織工程學(xué)的日益發(fā)展,為當(dāng)下由燒傷、化學(xué)損傷等原因引起的皮膚損傷患者帶來(lái)了福音。在皮膚組織工程技術(shù)中,種子細(xì)胞和生物相容性支架是其關(guān)鍵所在。而其中,間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是種子細(xì)胞的研究熱點(diǎn)。從人類(lèi)脂肪組織中分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞即稱為人脂肪干細(xì)胞(human adipose derived stem cells,hASCs),hASCs 具有易獲得、增殖速度快且可跨胚層多向分化等特點(diǎn),是良好的組織工程種子細(xì)胞。研究表明,hASCs可有效的減輕炎癥反應(yīng),促進(jìn)肉芽組織沉積、再上皮化、血管重建以及創(chuàng)面收縮,并且可以分化為表皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞,繼而達(dá)到使創(chuàng)面愈合的作用。研究表明,應(yīng)用單純干細(xì)胞進(jìn)行移植治療后,干細(xì)胞的存活率較低且存活時(shí)間較短,這被認(rèn)為是當(dāng)下限制干細(xì)胞治療的主要因素。生物醫(yī)學(xué)組織工程的發(fā)展帶來(lái)的支架材料的改進(jìn)為干細(xì)胞再生治療提供了新的策略。Matrigel是一種可溶性的基底膜基質(zhì),是EHS(Engelbreth-Holm-Swarm,EHS)小鼠肉瘤細(xì)胞分泌的一種凝膠狀蛋白質(zhì)混合物,主要成分包括:層黏連蛋白、膠原Ⅴ、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等,同時(shí)含轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、組織纖維酶原活化因子和其它在EHS肉瘤中自然表達(dá)的生長(zhǎng)因子等,具有非常良好的可注射性以及組織相容性,由于Matrigel的構(gòu)成類(lèi)似于許多組織中發(fā)現(xiàn)的復(fù)雜細(xì)胞外環(huán)境,因而被細(xì)胞生物學(xué)家廣泛的用作培養(yǎng)細(xì)胞的底物,應(yīng)用于細(xì)胞生長(zhǎng)、分化以及功能形態(tài)研究。因此,我們推測(cè)Matrigel可為干細(xì)胞提供不被體內(nèi)微環(huán)境損傷的三維支持,是一種理想的可注射生物支架材料。研究目的:本研究通過(guò)將hASCs接種于Matrigel中,再進(jìn)一步將hASCs-Matrigel復(fù)合物采用局部注射方法移植至裸鼠背部全層皮膚缺損創(chuàng)面,進(jìn)而觀察其對(duì)創(chuàng)面修復(fù)的影響,并對(duì)其相關(guān)機(jī)理進(jìn)行研究,最終實(shí)現(xiàn)為臨床上皮膚創(chuàng)面尤其是難治性皮膚創(chuàng)面的臨床治療提供新的思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。研究方法:第一部分:選擇臨床上人脂肪抽吸手術(shù)所得脂肪組織作為人脂肪干細(xì)胞的來(lái)源,以酶消化法從人脂肪組織中提取hASCs接種于培養(yǎng)皿,使用HG-DMEM培養(yǎng)基將其培養(yǎng)至第三代。利用倒置顯微鏡對(duì)原代細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行觀察;使用流式細(xì)胞儀鑒定細(xì)胞表型;加入不同的誘導(dǎo)劑驗(yàn)證干細(xì)胞成骨分化及成脂分化的能力。第二部分:將人脂肪干細(xì)胞接種于Matrigel中,使用裸鼠建立背部全層皮膚缺損模型,并將實(shí)驗(yàn)用裸鼠隨機(jī)分為3組:設(shè)立復(fù)合治療組(hASCs+Matrigel),細(xì)胞治療組(hASCs)和對(duì)照組(PBS)。通過(guò)創(chuàng)面大體觀察來(lái)測(cè)定各組的愈合曲線進(jìn)而對(duì)各組的愈合情況進(jìn)行評(píng)估;通過(guò)活體成像觀察來(lái)確定hASCs移植后在裸鼠體內(nèi)的存活情況;各組分別在術(shù)后的1d、7d、14d獲取標(biāo)本,進(jìn)行標(biāo)本HE染色,免疫組化染色等方法觀察和比較各組創(chuàng)面愈合水平;應(yīng)用qPCR檢測(cè)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor,EGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b-fibroblast growth factor,b-FGF)以及血小板衍生因子(platelet derived growth factor-bb,PDGF-bb)的基因表達(dá),觀察hASCs注射至裸鼠皮膚創(chuàng)面的存活與轉(zhuǎn)歸。結(jié)果:第一部分:hASCs體外培養(yǎng)一周后,大多數(shù)細(xì)胞呈多邊形、梭形或不規(guī)則三角形,生長(zhǎng)呈旋渦狀或束狀。細(xì)胞傳代后增殖速度較快,一周后可達(dá)90%融合度,且其免疫表型與臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá)具有高度一致性。繼續(xù)培養(yǎng)可見(jiàn)hASCs展現(xiàn)出了良好的成骨、成脂的多向分化能力。成骨誘導(dǎo)在20日可達(dá)到90%以上分化;成脂誘導(dǎo)在10日可達(dá)到90%以上分化。第二部分:1.創(chuàng)面愈合方面,通過(guò)大體皮膚愈合后創(chuàng)面面積繪制愈合曲線并對(duì)其進(jìn)行統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)復(fù)合治療組(hASCs+Matrigel)愈合時(shí)間最短(與其余兩組差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),細(xì)胞治療組(hASCs)愈合時(shí)間次之(與對(duì)照組差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義),而對(duì)照組(PBS)愈合時(shí)間最長(zhǎng)。2.活體成像觀察結(jié)果顯示,復(fù)合治療組(hASCs+Matrigel)細(xì)胞熒光信號(hào)多于細(xì)胞治療組(hASCs),且復(fù)合治療組移植后的hASCs隨時(shí)間逐漸匯聚于皮膚創(chuàng)面,而細(xì)胞治療組移植后的hASCs相較于治療組則更加分散。3.病理學(xué)觀察HE染色結(jié)果顯示:各組術(shù)后第1d、7d以及14d取材行HE染色,可見(jiàn)術(shù)后第14d時(shí)復(fù)合治療組(hASCs+Matrigel)創(chuàng)面已經(jīng)完全愈合,表皮修復(fù)情況良好,呈復(fù)層上皮排列,同時(shí)可見(jiàn)部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。細(xì)胞治療組(hASCs)則仍有部分創(chuàng)面未能愈合,肉芽組織生長(zhǎng)良好,已修復(fù)部分的表皮修復(fù)情況良好,表皮呈復(fù)層上皮排列,肉芽組織以及創(chuàng)面表面仍可見(jiàn)較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組(PBS組)則仍有相當(dāng)一部分創(chuàng)面尚未能愈合,且已修復(fù)部分的表皮修復(fù)質(zhì)量明顯不及復(fù)合治療組(hASCs+Matrigel)與細(xì)胞治療組(hASCs),同時(shí)可見(jiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),在尚未愈合的創(chuàng)口周?chē)梢?jiàn)有瘢痕組織增生。4.各組術(shù)后第1d、7d、14d取組織樣本行CD31染色觀察,可見(jiàn)術(shù)后14d復(fù)合治療組(hASCs+Matrigel)創(chuàng)面已經(jīng)完全愈合,表皮修復(fù)情況良好,呈復(fù)層上皮排列,創(chuàng)面淺面可見(jiàn)新生血管,深部血管則呈垂直創(chuàng)面的方向生長(zhǎng),且血管密度較大,可見(jiàn)部分炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。細(xì)胞治療組(hASCs組)則仍有部分創(chuàng)面未能愈合,肉芽組織生長(zhǎng)良好,新生血管密度較為豐富,已修復(fù)部分的表皮修復(fù)情況良好,表皮呈復(fù)層上皮排列,肉芽組織以及創(chuàng)面表面仍可見(jiàn)較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。對(duì)照組(PBS組)則有相當(dāng)一部分創(chuàng)面尚未能愈合,炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較明顯,肉芽組織中新生血管數(shù)量較前兩組有明顯減少;qPCR結(jié)果顯示術(shù)后7d、14d復(fù)合治療組(hASCs+Matrigel)與細(xì)胞治療組(hASCs)的VEGF、EGF、bFGF、FDGF-bb基因表達(dá)均有所增高,而對(duì)照組則無(wú)明顯變化,其中復(fù)合治療組增高最為顯著,與細(xì)胞治療組(hASCs組)及對(duì)照組(PBS)均存在顯著性差異,而細(xì)胞治療組(hASCs)同時(shí)也與對(duì)照組(PBS)存在顯著性差異。研究結(jié)論:1.我們從臨床脂肪抽吸手術(shù)中獲取人脂肪組織抽吸物,并復(fù)制經(jīng)典的酶消化法從中分離出了 hASCs,通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)與傳代獲得第三代hASCs,并參照國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其加以鑒定,從而獲得了本實(shí)驗(yàn)所需的種子細(xì)胞。2.Matrigel復(fù)合hASCs可提高細(xì)胞在皮膚創(chuàng)面的存活率,并延長(zhǎng)細(xì)胞的存活時(shí)間,從而增強(qiáng)人脂肪干細(xì)胞促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用。3.人脂肪干細(xì)胞局部注射治療裸鼠全層皮膚缺損,可誘導(dǎo)創(chuàng)面局部的微血管再生,而Matrigel所提供的三維支持環(huán)境可以增強(qiáng)人脂肪干細(xì)胞的旁分泌作用,使促血管生成因子表達(dá)增強(qiáng),使創(chuàng)面區(qū)域生成的微血管數(shù)量增多。4.人脂肪干細(xì)胞移植于裸鼠皮膚缺損區(qū)后可分化為表皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞等。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08;R64

【參考文獻(xiàn)】

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1 朱桂英;柴家科;;脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)及其作用機(jī)制探討[J];中國(guó)美容醫(yī)學(xué);2012年03期

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本文編號(hào)：1496459