本文關(guān)鍵詞：自體組織化膨體聚四氟乙烯抗感染能力的實驗研究　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景和目的： 生物材料廣泛應(yīng)用于各個領(lǐng)域,臨床常見的軟組織填充材料主要有膨體聚四氟乙烯(expended polytetrafluoroethylene, ePTFE)、硅橡膠(silicone rubber, SR)、羥基磷灰石(hydroxyapatite, HA)、高密度聚乙烯(high density polyethylene, HDPE)等膨體聚四氟乙烯(expanded polytetrafluoroethylene, ePTFE)是常用于臨床的高分子軟組織填充材料之一,質(zhì)地軟,含微孔(直徑平均長度50μ m),允許細胞、組織長入,組織粘附性強,生物相容性佳,是一種理想的軟組織充填人工材料,由于血管、組織可在材料內(nèi)部生長,因此其手術(shù)遠期固定效果好,形態(tài)自然,而其缺點是質(zhì)地軟,內(nèi)部結(jié)構(gòu)受壓后易變形,血管組織不易長入材料內(nèi)部,且長期與周邊組織摩擦力的作用下產(chǎn)生顆粒、微屑,容易引發(fā)慢性感染。整形外科手術(shù)術(shù)前消毒是無法完全將鼻腔、耳部藏匿的細菌徹底清除,因此容易將細菌帶入術(shù)區(qū),常見的病原菌為定居在人體皮膚和粘膜表面的條件致病菌,又稱機會致病菌,當其集聚部位改變、機體抵抗力降低或菌群失調(diào)時則可致病,條件致病菌常伴隨生物材料的植入長期駐入體內(nèi),其中尤以表皮葡萄球菌常見,表皮葡萄球菌入侵至材料表面,首先經(jīng)歷一個動態(tài)可逆吸附和不可逆粘附過程,細菌在材料表面生長、繁衍,同時材料表面能吸附組織、細胞分泌的黏連蛋白、細胞外基質(zhì),人體組織細胞分泌物與細菌混合形成水合多聚糖生物膜,該膜能保護內(nèi)部細菌抵抗宿主免疫機制及抗生素的作用,從而抗生素無法徹底清除細菌,又能促進細菌進一步粘附,且膜內(nèi)細菌代謝率降低,在能量供給不足的情況下可長期存活,甚至部分細菌因此逃脫人體免疫機制,長期潛伏于細胞內(nèi),所以生物膜內(nèi)游離或釋放出來的細菌進入組織和血液便成為慢性感染源。另外,相對于正常組織,生物材料作為異物植入體內(nèi)可降低誘發(fā)感染的最低細菌數(shù)量,從而容易導(dǎo)致感染。臨床上,人體某些部位如鼻部、耳部皮膚厚度薄,材料植入后組織容易缺血、壞死,假體外露發(fā)生率的風險大大增加,如ePTFE感染外露率8-10%, medpor材料植入耳支架再造術(shù)后3-6個月期間易發(fā)生慢性感染,材料外露率達到16.22-20%,經(jīng)過顳筋膜瓣加游離植皮包裹支架等諸如此類的手術(shù)改良法,材料外露的病例仍然常見。目前生物材料表面改性是常見而有效的手段,主要包括化學(xué)法(表面化學(xué)接枝、耦合接枝、化學(xué)浸漬),物理法(高能輻射線、紫外光輻照、低溫等離子體),生物法(蛋白涂層、生物表面修飾工程)等,方法眾多,仍受經(jīng)濟、技術(shù)、原材料等多方面因素制約。如何提高生物材料抑制細菌粘附的能力,預(yù)防細菌生物膜的形成及改善其生物相容性是目前生物材料改良技術(shù)研究的熱點。 在組織工程學(xué)中,生物醫(yī)用材料支架通過細胞體外培養(yǎng)或構(gòu)建修復(fù)器官、組織,最后植入體內(nèi)與機體周圍結(jié)締組織及血管相結(jié)合,本課題組考慮將生物材料植入動物體內(nèi)較體外更易培養(yǎng)細胞組織,因此提出“材料自體組織化”的概念,即將材料預(yù)先放入機體皮下血供較豐富的深部組織,埋植一段時間后,機體血管組織長入并填滿材料內(nèi)部孔隙,形成一個攜帶微血管循環(huán)結(jié)構(gòu)、結(jié)締組織、細胞因子等物質(zhì)的復(fù)合物。具體方法是將ePTFE預(yù)先在大鼠自體體內(nèi)埋植,讓血管和組織向微孔內(nèi)適度生長,分別在4、8、12周觀察材料與自身結(jié)締組織血管結(jié)合長入情況,確定材料與組織融合最佳狀態(tài)的時間點,取出最佳融合狀態(tài)的復(fù)合物,再次行手術(shù)將其轉(zhuǎn)移至靶向埋植部位,且術(shù)中傷口內(nèi)注入細菌,通過肉眼觀察、HE染色、電鏡觀察及細菌粘附量計數(shù)評價自體組織化ePTFE抗感染能力及相關(guān)組織學(xué)的變化。 研究方法：本研究分為二部分： 第一部分：自體組織化膨體聚四氟乙烯的模型建立 1.無菌條件下,消毒ePTFE片備用。30只SD大鼠全身麻醉,腹部備皮,消毒鋪巾,在腹部正中作長約lcm切口,逐層分離至腹膜下,形成約3cm X3cm大小潛行腔隙。將備用ePTFE片放入潛腔,切口縫合、消毒。 2.埋植時間4、8、12周。 3.分別在4、8、12周后取出材料,HE染色,步驟：①取出埋植于大鼠腹壁內(nèi)ePTFE片,生理鹽水沖洗3次。②將ePTFE片放入4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定24h。③70%、85%、95%、100%乙醇溶液中脫水。④二甲苯溶液透明。⑤石蠟包埋。⑥切片。⑦蘇木精-伊紅染色。 第二部分：自體組織化膨體聚四氟乙烯抗感染能力的研究 1.30只SD大鼠隨機分為3組(A、B、C組),每組10只。 2.大鼠全身麻醉,背部、腹部備皮,消毒鋪巾,取出30塊自體組織化ePTFE片,放入PS液中備用。 3.大鼠背部消毒鋪巾,分別在兩側(cè)脊柱旁2cm處作長2.5cmx2.5cm切口,每側(cè)切口內(nèi)各注入SE菌液10μ L(含菌量105～106CFU),按隨機原則背部左、右側(cè)傷口內(nèi)分別埋植自體組織化ePTFE片、ePTFE片,30處埋植ePTFE片為對照組,30處埋植自體組織化ePTFE片為實驗組,傷口縫合、消毒包扎。4.炎癥評價：術(shù)后1、2、4周內(nèi)每天觀察大鼠背部左、右側(cè)傷口有無血腫、皮瓣壞死、感染、排斥、材料移位及脫落情況。炎癥評價標準：按血腫形成的大小、皮瓣壞死百分比及植入材料脫落程度,參照Neel的分級方法分為3級：0級表示表示不存在；1級表示輕度；2級表示中度；3級表示重度或廣泛血腫形成或皮瓣壞死。5.術(shù)后1、2、4周,分別依次取出A、B、C三組所有大鼠背部埋植的材料,自體組織化ePTFE片為實驗組,普通ePTFE片為對照組,用無菌水清洗10次,去除材料表面未粘附上的細菌,然后放入2mL的滅菌水,混合振蕩器振蕩15min,徹底將已在材料表面粘附的細菌洗脫。最后,各取稀釋菌液1μ L分別接種于血瓊脂平板,溫度37℃,放入細菌孵育箱過夜培養(yǎng),計數(shù)平板生長細菌菌落個數(shù)。6.電鏡(SEM)觀察分別取出自體組織化ePTFE片、普通ePTFE片,PBS液沖洗,10%四氧化鋨液固定,乙醇梯度脫水,乙酸異戊酯置換,自然法干燥,噴金,掃描電鏡觀察細菌粘附材料表面情況。 研究結(jié)果 1.肉眼觀察： 1.1自體組織化膨體聚四氟乙烯的模型建立 (1)ePTFE片自體組織化4周,材料周圍可見透明薄膜形成,但內(nèi)部并無機體血管、組織長入。 (2)ePTFE片自體組織化8周,材料周圍可見較為致密透明薄膜形成,內(nèi)部可見部分機體血管、組織長入。 (3)ePTFE片自體組織化12周,外周有致密透明纖維囊,內(nèi)部可見大量機體微血管、組織長入,且將材料固定于周圍組織中,不易取出。 1.2自體組織化膨體聚四氟乙烯抗感染能力的研究 (1)注入SE菌液術(shù)后1周,自體組織化ePTFE片與周圍組織緊密牢固地結(jié)合,表面有新生血管長入材料內(nèi)部,無明顯炎癥表現(xiàn),ePTFE片與周圍組織無粘連,未見明顯組織、血管長入,在材料周圍可見膿性、黃色黏狀分泌物。 (2)注入SE菌液術(shù)后2周,自體組織化ePTFE片與周圍組織緊密牢固地結(jié)合,表面有新生血管長入材料內(nèi)部,無明顯炎癥表現(xiàn)；ePTFE片與周圍組織基本無粘連,無組織、血管長入,材料表面附有少許淡黃色、灰白色膿性黏狀分泌物,周圍組織有部分壞死、積液。 (3)注入SE菌液術(shù)后4周,體內(nèi)組織化ePTFE片與周圍組織緊密牢固地結(jié)合,表面有新生血管長入材料內(nèi)部,無明顯炎癥；ePTFE片與周圍組織輕度粘連,未見明顯組織、血管長入,材料表面淡黃色、灰白色膿性黏狀分泌物有所減少,周圍壞死組織結(jié)節(jié)化,瘢痕明顯,傷口愈合延遲。 2.HE染色 2.1自體組織化膨體聚四氟乙烯的模型建立 (1)ePTFE片自體組織化4周,組織、細胞浸潤材料內(nèi)部深度約為1/3,外周逐漸形成透明、斷續(xù)的薄膜。 (2)ePTFE片自體組織化8周,組織、細胞浸潤材料內(nèi)部深度約為1/2,外周基本可見比較完整透明薄膜。 (3)ePTFE片自體組織化12周,外周已形成一層成熟完整的透明纖維囊,其間微血管、組織填滿材料孔隙內(nèi)。 2.2自體組織化ePTFE抗感染能力的研究 注入SE菌液術(shù)后1周,ePTFE片內(nèi)部浸潤大量炎癥細胞,并在材料周圍形成肉芽腫樣組織,無血管組織長入材料內(nèi)部；而自體組織化ePTFE片內(nèi)部僅有少量炎癥細胞浸潤,組織血管已長入材料內(nèi)部,與周圍結(jié)構(gòu)結(jié)合緊密。 3.炎癥評價： (1)1周后,實驗組3處0級、4處1級、3處2級、0處3級；對照組1處0級、2處1級、5處2級、2處3級。 (2)2周后,實驗組8處0級、2處1級、0處2級、0處3級；對照組4處0級、5處1級、1處2級、0處3級。 (3)4周后,實驗組10處0級、0處1級、0處2級、0處3級；對照組9處0級、1處1級、0處2級、0處3級。 總計8例大鼠死亡,死亡率為26.7%。 4.細菌計數(shù) (1)1周后,實驗組表皮葡萄球菌粘附菌落形成單位(7.41±1.3)X107CFU/L、對照組(19.67±2.51)X107CFU/L,實驗組粘附細菌數(shù)量少于對照組(P0.05) (2)2周后,實驗組表皮葡萄球菌粘附菌落形成單位(3.94±1.00)X107CFU/L、對照組(8.75±1.7)X107CFU/L,實驗組粘附細菌數(shù)量少于對照組(P0.05) (3)4周后,實驗組表皮葡萄球菌粘附菌落形成單位(1.97±0.89)X107CFU/L、對照組(3.66±1.8)X107CFU/L,實驗組粘附細菌數(shù)量均明顯少于對照組(P0.05) 結(jié)論 1.ePTFE自體組織化4、8周時,組織血管長入材料內(nèi)部較淺,組織、血管易與材料分離。12周時,材料緊貼腹壁,加壓推擠后不會移位,材料內(nèi)部有大量血管及組織緊密長入材料將其包裹,因此,ePTFE達到充分自體組織化需要12周。 2.本課題組構(gòu)建的自體組織化ePTFE模型可在動物體內(nèi)應(yīng)用。 3.大鼠背部雙側(cè)傷口注入等量SE菌液1、2、4周,自體組織化ePTFE實驗組與ePTFE對照組炎癥程度比較,實驗組炎癥程度評分明顯低于對照組。 4.大鼠背部雙側(cè)傷口注入等量SE菌液1、2、4周,自體組織化ePTFE實驗組與ePTFE對照組表面粘附細菌的數(shù)量比較,實驗組粘附細菌的數(shù)量明顯低于對照組,且兩組材料細菌粘附數(shù)量均與時間成反比。 5.自體組織化ePTFE植入靶向部位1周后即能與機體組織建立緊密聯(lián)系,融合能力較ePTFE強,生物相容性佳。 6.材料自體組織化的方法對下一步在臨床上medpor材料支架耳廓再造、膨體聚四氟乙烯隆鼻等手術(shù)中的推廣有指導(dǎo)意義。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R318.08

【參考文獻】

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本文編號：1400968