本文關(guān)鍵詞：外源性TGF-β1和IGF-1誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化軟骨細(xì)胞的實驗研究

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【摘要】：目的： 關(guān)于體外培養(yǎng)、鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)以及誘導(dǎo)MSCs定向分化為軟骨細(xì)胞,目前尚缺乏相對完整和規(guī)范的實驗方法。本課題擬通過對MSCs的體外培養(yǎng)、擴(kuò)增,研究MSCs一般形態(tài)結(jié)構(gòu)；通過流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光法結(jié)合MSCs分化功能法共同鑒定MSCs;胰島素樣生長因子-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)誘導(dǎo)MSCs定向分化為軟骨細(xì)胞,將不同時間段內(nèi)單獨(dú)使用和聯(lián)合使用兩種誘導(dǎo)因子對所誘導(dǎo)出的細(xì)胞Ⅱ型膠原表達(dá)量的影響相比較；通過光鏡和電鏡研究誘導(dǎo)前后MSCs細(xì)微、超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)改變,同時檢測TGF-β1和IGF-1對MSCs增殖能力的影響,為進(jìn)一步開發(fā)MSCs作為組織工程氣管軟骨種子細(xì)胞和體外構(gòu)建組織工程氣管軟骨提供實驗基礎(chǔ)和技術(shù)可行性。 方法： 1MSCs獲取、培養(yǎng)、純化與鑒定 1.1MSCs獲取、培養(yǎng)及純化：①頸椎脫臼處死大鼠,無菌條件下分離大鼠股骨和脛骨,取骨髓；②通過換液及傳代去除雜質(zhì)細(xì)胞。光鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。 1.2MSCs的鑒定：①形態(tài)學(xué)鑒定免疫熒光法；②表型鑒定流式細(xì)胞術(shù)；③功能鑒定誘導(dǎo)MSCs定向分化為軟骨細(xì)胞。 1.3MTT法檢測采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)微量酶反應(yīng)比色法檢測TGF-β1、 IGF-1及TGF-β1+IGF-1對MSCs增殖能力的影響。 1.4掃描電鏡觀察MSCs誘導(dǎo)前形態(tài)。 1.5透射電鏡觀察MSCs誘導(dǎo)前形態(tài)。 2誘導(dǎo)MSCs定向分化為軟骨細(xì)胞。 2.1體外誘導(dǎo)及分組根據(jù)誘導(dǎo)分化因子使用方法,實驗分四組：A組：50ng/ml IGF-1和10ng/ml TGF-β1。B組：10ng/ml TGF-β1。C組：50ng/ml IGF-1。對照組：單獨(dú)使用DMEM高糖培養(yǎng)基,不加誘導(dǎo)分化因子。A、B、C組在DMEM高糖培養(yǎng)基里加入維生素C50μg/ml、胰島素6.25μg/ml、地塞米松51.6ng/ml作為基礎(chǔ)誘導(dǎo)分化液。取第四代MSCs按1×105/ml接種于六孔板,內(nèi)置蓋玻片行細(xì)胞爬片。光鏡觀察MSCs誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)改變。 2.2掃描電鏡觀察MSCs誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)變化。 2.3透射電鏡觀察MSCs誘導(dǎo)后形態(tài)學(xué)變化。 2.4MSCs誘導(dǎo)分化軟骨細(xì)胞后鑒定：①Ⅱ型膠原免疫熒光染色②RT-PCR檢測③Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色,多種方法共同鑒定MSCs誘導(dǎo)出的軟骨細(xì)胞。 結(jié)果： 1光鏡觀察原代培養(yǎng)24h后首次換液,去除未貼壁細(xì)胞,大部分細(xì)胞呈梭型、三角形,小部分呈圓形。3代后細(xì)胞純化,MSCs形態(tài)均一,雜質(zhì)細(xì)胞極少見。誘導(dǎo)7d后MSCs形態(tài)開始發(fā)生改變,逐漸轉(zhuǎn)變成三角形、星形、多邊形,21d后絕大多數(shù)MSCs呈三角形、星形、多邊形細(xì)胞形態(tài),可見多個突起。 2MSCs鑒定①流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示實驗所培養(yǎng)的細(xì)胞廣泛高度表達(dá)CD90、 CD29,而極少表達(dá)CD34、CD45。②MSCs免疫熒光顯示MSCs表達(dá)CD90、CD29陽性率在99%以上,而不表達(dá)CD34、CD45。 3MTT法檢測A組、B組和C組增殖活性高于對照組(P0.05)。TGF-β1、IGF-1可增強(qiáng)MSCs增殖活性。 4掃描電鏡觀察MSCs呈長梭形,扁平伸展?fàn)?可見突起。誘導(dǎo)兩周MSCs體積增大,呈多邊形、三角形、星形,可見多個突起。 5透射電鏡觀察MSCs誘導(dǎo)前透射電鏡見一個細(xì)胞核,可見一個核仁。胞漿見線粒體。細(xì)胞誘導(dǎo)7d后細(xì)胞核增大,核仁增多。誘導(dǎo)14d見線粒體、粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和空泡較7d時增加,可見較多的微絨毛和脂滴。誘導(dǎo)21d空泡和脂滴增加,可見數(shù)個髓鞘樣小體。 6MSCs誘導(dǎo)出軟骨細(xì)胞后鑒定： 6.1Ⅱ型膠原免疫熒光染色誘導(dǎo)21d后,A組、B組免疫熒光顯示胞漿呈棕紅色,高度表達(dá)Ⅱ型膠原,而C組和對照組結(jié)果呈陰性。 6.2RT-PCR檢測Ⅱ型膠原表達(dá)RT-PCR結(jié)果顯示A組和B組電泳中可見Ⅱ型膠原擴(kuò)增條帶,呈陽性,C組和對照組呈陰性。 6.3Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色A組和B組Ⅱ型膠原染色呈陽性,胞漿呈棕黃色。而C組和對照組結(jié)果呈陰性。以JEDR8010D形態(tài)圖像分析軟件VESION1.0掃描,結(jié)果顯示A組Ⅱ型膠原表達(dá)量比B組顯著提高(P0.01),且隨著時間的延長,表達(dá)量逐漸增加。 結(jié)論： 本實驗采用全骨髓培養(yǎng)+貼壁純化法分離培養(yǎng)MSCs,培養(yǎng)出大量高度純化的MSCs,可滿足MSCs作為種子細(xì)胞構(gòu)建組織工程氣管軟骨需求,全骨髓培養(yǎng)+貼壁純化法是值得推薦的MSCs培養(yǎng)方法。流式細(xì)胞術(shù)、免疫熒光法結(jié)合MSCs分化功能法是目前MSCs較為理想的鑒定方法。TGF-β1與IGF-1對MSCs均有促增殖作用,MSCs誘導(dǎo)分化為軟骨細(xì)胞時細(xì)微和超微結(jié)構(gòu)改變提示細(xì)胞分化、代謝功能旺盛。聯(lián)合使用TGF-β1、 IGF-1誘導(dǎo)MSCs在體外定向分化為軟骨細(xì)胞,TGF-β1和IGF-1協(xié)同刺激MSCs分化為軟骨細(xì)胞,可獲得了較佳的誘導(dǎo)效應(yīng),從而構(gòu)建出目前較為完整的、規(guī)范的體外培養(yǎng)MSCs、誘導(dǎo)MSCs定向分化為軟骨細(xì)胞的模型,為進(jìn)一步應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)氣管軟骨缺損提供了實驗基礎(chǔ)與技術(shù)可行性。
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R318.08

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前5條

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本文編號：1243635