本文關(guān)鍵詞：P物質(zhì)對(duì)BMSCs源性內(nèi)皮與成骨細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)體系的作用效果觀察

  更多相關(guān)文章： P物質(zhì) BMSCs 成骨細(xì)胞 內(nèi)皮細(xì)胞 共培養(yǎng)

【摘要】：各種原因造成的臨床大段骨缺損以及骨不連的修復(fù)問(wèn)題，都是骨科學(xué)術(shù)界一直以來(lái)研究的熱點(diǎn)以及難點(diǎn)。目前臨床上通常采用的處理辦法包括自體骨移植和異體骨移植，然而其相關(guān)技術(shù)均不同程度地存在一些不足，故而無(wú)法達(dá)到臨床的實(shí)際應(yīng)用需求。隨著骨組織工程領(lǐng)域不斷深入的研究，其為臨床骨缺損的修復(fù)提供了新的思路和方法。組織工程骨材料復(fù)合種子細(xì)胞以及神經(jīng)因子應(yīng)用于大段骨缺損修復(fù)，具有良好的可塑性以及成骨效應(yīng)，臨床應(yīng)用備受期待。 骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，涉及多種細(xì)胞和細(xì)胞因子之間的協(xié)同作用。生長(zhǎng)因子作為人體組織和器官發(fā)生、發(fā)育以及成熟的重要物質(zhì)，為骨缺損修復(fù)提供最基本的營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)，而神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)骨代謝的影響作用尤為突出。P物質(zhì)（substance P，SP）是最早發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)肽遞質(zhì)，已經(jīng)證實(shí)SP神經(jīng)肽來(lái)源于感覺(jué)神經(jīng)纖維，可作用于成骨細(xì)胞，且貫穿于骨折愈合的整個(gè)過(guò)程。然而目前的實(shí)驗(yàn)研究存在分歧，SP對(duì)骨代謝成骨細(xì)胞的作用效果尚不明確。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)，成骨細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞體外聯(lián)合共培養(yǎng)體系，可促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖以及組織工程骨的血管化再生進(jìn)程，有助于增強(qiáng)組織工程骨對(duì)骨缺損的修復(fù)。因此，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）源性內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）與成骨細(xì)胞（OB）體外聯(lián)合培養(yǎng)體系，觀察SP對(duì)此共培養(yǎng)細(xì)胞體系的最適濃度以及作用效果，明確SP對(duì)內(nèi)皮與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系功能的影響，探索SP在骨缺損修復(fù)中的應(yīng)用前景。 目的： 觀察P物質(zhì)(substance P，SP)在骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）源性內(nèi)皮細(xì)胞（ECs）與成骨細(xì)胞（OB）體外聯(lián)合培養(yǎng)體系中的最適濃度；以及其對(duì)BMSCs源性內(nèi)皮與成骨細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)的作用，為應(yīng)用SP促進(jìn)組織工程骨修復(fù)骨缺損提供實(shí)驗(yàn)支持。 方法： 第一部分：P物質(zhì)在BMSCs源性內(nèi)皮與成骨細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)體系中的最適濃度 采用新生新西蘭大白兔胎兔（雌雄不限）密度梯度離心法分離骨髓基質(zhì)干細(xì)胞行體外培養(yǎng)和連續(xù)傳代,獲得較純的BMSCs。連續(xù)傳代后第3代BMSCs進(jìn)行分化誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞以及成骨細(xì)胞，并進(jìn)行細(xì)胞相關(guān)定性檢測(cè)鑒定。兩種細(xì)胞誘導(dǎo)7d后，將其按照1：2比例直接混合培養(yǎng)，待細(xì)胞傳至第2代后，加入1×10-12-1×10-6mol/L不同濃度的SP作為實(shí)驗(yàn)組，以正常未加SP的細(xì)胞培養(yǎng)基為對(duì)照組。培養(yǎng)后1、3、5、7d采用CCK-8法測(cè)定細(xì)胞增殖活性，并用sigma-plot軟件生成生長(zhǎng)曲線，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)數(shù)量，測(cè)定堿性磷酸酶活性及骨鈣素表達(dá)量。 第二部分：P物質(zhì)對(duì)BMSCs源性內(nèi)皮與成骨細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)體系的作用效果觀察 分別建立BMSCs源性內(nèi)皮細(xì)胞(ECs)與成骨細(xì)胞（OB）單獨(dú)培養(yǎng)，或按1:2的比例體外直接或間接共培養(yǎng)體系，細(xì)胞內(nèi)同時(shí)加入1×10-8mol/L SP。培養(yǎng)48小時(shí)后采用流式細(xì)胞周期分析細(xì)胞增殖與活性，并分別采用酶聯(lián)免疫法（ELISA）檢測(cè)堿性磷酸酶（ALP）的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR（rt-PCR）檢測(cè)骨鈣素（OC）mRNA基因的表達(dá)。以不添加SP的細(xì)胞培養(yǎng)體系作為對(duì)照組，比較加入SP時(shí)各組細(xì)胞功能的變化。 結(jié)果： 第一部分 CCK-8曲線圖可以直觀的看出1d時(shí)除低濃度組1×10-12mol/L作用效果不明顯外，其余SP濃度組作用效果明顯；3d以后SP各濃度組對(duì)共培養(yǎng)細(xì)胞均具有促進(jìn)作用且隨著時(shí)間的推移作用效果呈現(xiàn)增長(zhǎng)，而SP濃度組1×10-8mol/L時(shí)細(xì)胞的促進(jìn)增殖效果最明顯，組間比較效果顯著，細(xì)胞增生活躍。堿性磷酸酶ALP活性表達(dá)結(jié)果提示3d以后SP作用效果明顯，低濃度組1×10-12mol/L作用效果不明顯，而1×10-8-1×10-6mol/L作用效果明顯。骨鈣素（BGP）的表達(dá)檢測(cè)中3d以后各濃度SP實(shí)驗(yàn)組較空白對(duì)照均有所提高，而在1×10-8mol/L的SP濃度組作用效果最明顯，且在1×10-8mol/L濃度組相較于其他SP實(shí)驗(yàn)組也具有顯著性差異。 第二部分： 較OB單獨(dú)培養(yǎng)，間接共培養(yǎng)時(shí)流式細(xì)胞周期檢測(cè)表現(xiàn)為G1期明顯減少，S期阻滯（P0.05）；ALP的表達(dá)有所提高（P0.05）；OC mRNA的表達(dá)則顯著性升高（P0.001）。較OB單獨(dú)培養(yǎng)，直接共培養(yǎng)時(shí)ALP和OC mRNA的表達(dá)均顯著性升高（P0.001）。在促進(jìn)ALP和OC mRNA的表達(dá)上，直接共培養(yǎng)較間接共培養(yǎng)均有所提高（P0.05）。加入SP后,實(shí)驗(yàn)組OB單獨(dú)培養(yǎng)相較對(duì)照組OB單獨(dú)培養(yǎng),流式細(xì)胞周期檢測(cè)顯示細(xì)胞阻滯于G2/M期，，G1期明顯減少（P0.05）；ALP活性有所升高，OC的mRNA的表達(dá)水平也有所提高（P0.05）。實(shí)驗(yàn)組共培養(yǎng)細(xì)胞較對(duì)照組共培養(yǎng)細(xì)胞,流式細(xì)胞周期檢測(cè)顯示G1期明顯減少（P0.001），細(xì)胞阻滯于G2/M及S期；ALP的表達(dá)有所上升，OC的mRNA的表達(dá)水平有所提高（P0.05）。 結(jié)論： 在體外內(nèi)皮與成骨細(xì)胞聯(lián)合共培養(yǎng)中,SP對(duì)新種子細(xì)胞促進(jìn)效果明顯，其在1×10-8mol/L對(duì)聯(lián)合共培養(yǎng)的成骨細(xì)胞增殖和活性作用最強(qiáng)。BMSCs源性內(nèi)皮細(xì)胞與成骨細(xì)胞共培養(yǎng)體系細(xì)胞相容性良好，SP可促進(jìn)OB的活性,并且可顯著促進(jìn)共培養(yǎng)體系中OB的增殖與活性。
【關(guān)鍵詞】：P物質(zhì) BMSCs 成骨細(xì)胞 內(nèi)皮細(xì)胞 共培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R318.08
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-15
• 文獻(xiàn)回顧15-22
• 一、SP 分子生物學(xué)特性15-16
• 二、SP 受體16-19
• 三、SP 在骨代謝中的作用19-22
• 第一部分 P 物質(zhì)在 BMSCS 源性內(nèi)皮與成骨細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)體系中的最適濃度.1922-38
• 1 實(shí)驗(yàn)材料22-24
• 2 實(shí)驗(yàn)方法24-29
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-34
• 4 討論34-38
• 第二部分 P物質(zhì)對(duì)BMSCS源性內(nèi)皮與成骨細(xì)胞體外聯(lián)合培養(yǎng)體系的作用效果觀察38-49
• 1 實(shí)驗(yàn)材料38-40
• 2 實(shí)驗(yàn)方法40-42
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-46
• 4 討論46-49
• 小結(jié)49-50
• 參考文獻(xiàn)50-61
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果61-62
• 致謝62

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1002886