本文關(guān)鍵詞：USP39在黑色素瘤增殖中的作用和機(jī)制研究

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【摘要】：黑色素瘤是一種起源于黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤,其惡性程度極高,預(yù)后較差。對于早期黑色素瘤患者予以手術(shù)切除后,仍有較高的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移率。而晚期的黑色素瘤患者接受放療和化療的結(jié)果都很不令人滿意。近年來,抑制致病基因的靶向治療藥物顯著提高了患者的生存率。但是,對靶向藥物的原發(fā)和繼發(fā)性耐藥是黑色素瘤治療中的一個棘手的問題。因此,亟需尋找新的針對黑色素瘤的治療靶點(diǎn),以建立個性化的治療方案,提高患者生存率。近年來,研究發(fā)現(xiàn)除了蛋白質(zhì)激酶外,物質(zhì)代謝、RNA剪切、免疫系統(tǒng)及表觀遺傳學(xué)等多個生物學(xué)過程均在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到了非常重要的作用。參與這些過程的各種因子都可能是潛在的腫瘤藥物作用靶點(diǎn)。剪接體(Spliceosome)參與前體m RNA的編輯,近年來研究表明其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切的聯(lián)系。真核生物斷裂基因,先轉(zhuǎn)錄成包含非編碼區(qū)的前體m RNA(pre-m RNA),在剪接的協(xié)助下,去除內(nèi)含子,并將外顯子進(jìn)行連接后,進(jìn)而形成成熟的m RNA。剪接體由小分子核糖核蛋白(sn RNP)和近百種蛋白質(zhì)組成的一種特異的RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體。每一種sn RNP(U1,U2,U4/U6,and U5)包含一種富含嘧啶堿基的核小RNA(sn RNA)。在m RNA剪接過程中,U1、U2 sn RNP先在pre-m RNA上定位,招募U4/U6sn RNP和U5sn RNP形成U4/U6-U5 tri-sn RNP復(fù)合物完成剪接體組裝。此時,U1、U4脫離pre-m RNA,剪接體發(fā)生酶促反應(yīng)切除基因的內(nèi)含子并連接外顯子。完成反應(yīng)后,剪接體的各部分也相應(yīng)解離釋放,以便重復(fù)利用。m RNA的剪接對包括細(xì)胞周期、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及凋亡在內(nèi)的許多基因的表達(dá)有重要影響。近年來,多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)剪接體相關(guān)基因存在突變和表達(dá)異常,其中包括SF3B1,ZRSR2,U2AF1,SRSF2等。剪接體相關(guān)基因可能成為一個潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。USP39是一種去泛素化酶,屬于泛素蛋白特異性蛋白酶家族中的一員。USP39基因及其編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)是高度保守的。在人類,小鼠,斑馬魚及酵母中該基因有高度的同源性。USP39蛋白由一個鋅指泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個泛素蛋白特異性蛋白酶結(jié)構(gòu)域組成。由于USP39缺乏三個主要的酶活性位點(diǎn),所以USP39缺乏泛素蛋白酶活性。功能學(xué)研究提示USP39對招募U4/U6-U5 tri-sn RNP定位于剪接體前體有重要作用,但其對維持U4/U6-U5 tri-sn RNP的穩(wěn)定性不是必需的。缺乏USP39則無法形成成熟的剪接體。通過對USP39的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析提示其Zn F-UBD結(jié)構(gòu)域與USP家族其他成員的Zn F-UBD結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)相似,功能學(xué)預(yù)測USP39的Zn F-UBD結(jié)構(gòu)域可能起到激活其鄰近的USP結(jié)構(gòu)域的作用。近年研究提示,USP39在乳腺癌、肝癌及甲狀腺癌中高表達(dá)。在腫瘤細(xì)胞中,沉默USP39可導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯,并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡�？梢�,USP39扮演著癌基因的角色,并可能成為一個潛在的腫瘤治療靶點(diǎn)。而其在黑色素瘤中尚無人研究,因而有必要進(jìn)行深入研究探討。目的:1、檢測USP39在黑色素瘤中的表達(dá)情況,分析其表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特征間的相關(guān)性,探討其潛在的臨床價值。2、研究USP39在黑色素瘤增殖表型中的作用。3、探討USP39影響黑色素瘤增殖表型的可能分子機(jī)制。方法:1、利用免疫組織化學(xué)染色檢測USP39在黑色素瘤組織及良性痣組織中的表達(dá)情況,統(tǒng)計分析其表達(dá)水平與臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性,揭示USP39潛在的臨床應(yīng)用價值;2、構(gòu)建包裝USP39特異性的sh RNA慢病毒(Lv-sh USP39)和相應(yīng)的陰性對照慢病毒(Lv-sh Ctrl)。3、應(yīng)用上述慢病毒感染A375和M14細(xì)胞,篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株,Real time q PCR和Western blot證實(shí)其沉默USP39表達(dá)的有效性;4、采用MTT實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測USP39沉默對A375和M14細(xì)胞體外增殖能力以及克隆形成能力的影響;5、采用流式細(xì)胞術(shù)檢測USP39沉默對A375和M14細(xì)胞在細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡方面的影響;6、應(yīng)用裸鼠體內(nèi)成瘤模型觀察USP39沉默對A375細(xì)胞體內(nèi)成瘤能力的影響;7、應(yīng)用Western blot方法檢測細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡關(guān)鍵調(diào)控分子及MAPK/ERK通路關(guān)鍵分子ERK1/2的表達(dá)變化,初步探討USP39影響黑色素瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。結(jié)果:1.我們用免疫組化的方法檢測了70例黑色素瘤組織和50例良性痣組織USP39表達(dá)情況。結(jié)果表明,在70例黑色素瘤組織中,USP39蛋白表達(dá)的陽性率為95.7%(67/70),其中強(qiáng)陽性21例,中等強(qiáng)度陽性29例,弱陽性17例,陰性3例;而在50例良性痣組織中,USP39蛋白表達(dá)無強(qiáng)陽性者,中等強(qiáng)度陽性11例,弱陽性率為20例,陰性率19例。統(tǒng)計學(xué)分析提示USP39在黑色素瘤組織表達(dá)明顯高于與良性痣組織(p0.01)。但是,進(jìn)一步分析提示USP39在黑色素瘤組織中的表達(dá)與患者的年齡、性別、部位、有無潰瘍及轉(zhuǎn)移與否之間均無顯著性差異(P0.05)。2.為了探討USP39對黑色素瘤細(xì)胞A375和M14增殖表型的影響,我們成功構(gòu)建了USP39特異性的sh RNA慢病毒(Lv-sh USP39)和相應(yīng)的陰性對照(Lv-sh Ctrl)。用其感染A375和M14細(xì)胞后,Real time q PCR和Western blot證實(shí)USP39的表達(dá)水平明顯下調(diào)。3.MTT實(shí)驗(yàn)顯示,Lv-sh USP39感染的A375和M14細(xì)胞,其生長速度明顯慢于Lv-sh Ctrl感染的細(xì)胞(P0.01)。平板克隆形成實(shí)驗(yàn)表明,與Lv-sh Ctrl感染的A375和M14細(xì)胞相比,Lv-sh USP39感染的細(xì)胞克隆形成能力明顯降低、克隆形成數(shù)目明顯減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。4.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示,相對于陰性對照組細(xì)胞,USP39沉默組的A375和M14細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞明顯增加(P0.05),G2/M期細(xì)胞百分比則顯著降低(P0.01)。USP39沉默導(dǎo)致黑色素瘤細(xì)胞G0/G1期阻滯。5.流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果顯示,相對于陰性對照組,USP39沉默組的A375和M14細(xì)胞細(xì)胞凋亡明顯增加(P0.01)。USP39沉默誘導(dǎo)黑色素瘤細(xì)胞凋亡。6.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示Lv-sh USP39感染的A375細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)所形成的腫瘤體積和重量明顯小于于Lv-sh Ctrl感染的細(xì)胞,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。7.Western blot結(jié)果提示,USP39沉默可以上調(diào)p21和p27的表達(dá),下調(diào)Cyclin D1和CDK4的表達(dá)。同時,Western blot結(jié)果提示也提示,USP39沉默可以減少Bcl-2表達(dá),增加Bax的表達(dá),降低Bcl-2/Bax的比率。進(jìn)一步研究結(jié)果提示,USP39沉默后p-ERK1/2表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論:本研究首次發(fā)現(xiàn)USP39在黑色素瘤組織中呈現(xiàn)普遍高表達(dá),但其表達(dá)水平與患者的年齡、性別、發(fā)病部位、有無潰瘍及轉(zhuǎn)移與否之間無明顯關(guān)聯(lián)。沉默USP39可以抑制黑色素瘤細(xì)胞的體內(nèi)、體外增殖,誘導(dǎo)G0/G1期阻滯并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。沉默USP39可以影響黑色素瘤細(xì)胞中周期、凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),上調(diào)p21、p27和Bax的表達(dá),同時下調(diào)Cyclin D1、CDK4和Bcl-2的表達(dá)。USP39沉默后p-ERK1/2表達(dá)明顯下調(diào),提示其可能通過MAPK/ERK通路影響黑色素瘤的惡性增殖�？傊�,這些結(jié)果提示USP39在黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展中可能扮演促癌基因的角色,同時也為USP39作為治療中晚期黑色素瘤的潛在靶點(diǎn)提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：黑色素瘤 USP39 增殖 細(xì)胞周期 細(xì)胞凋亡
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 中英文縮寫詞對照7-9
• 中文摘要9-13
• ABSTRACT13-18
• 1. 前言18-24
• 2. 實(shí)驗(yàn)材料24-34
• 2.1 患者來源及臨床資料24-26
• 2.2 細(xì)胞株26
• 2.3 慢病毒質(zhì)粒載體26
• 2.4 實(shí)驗(yàn)動物26-27
• 2.5 主要試劑27-30
• 2.6 主要儀器30-31
• 2.7 溶液和試劑的配制31-34
• 3 實(shí)驗(yàn)方法34-51
• 3.1 免疫組化34-35
• 3.2 質(zhì)粒構(gòu)建35-39
• 3.3 病毒包裝39
• 3.4 病毒收獲和濃縮及滴度測定39-40
• 3.5 細(xì)胞培養(yǎng)40-41
• 3.6 病毒感染41
• 3.7 實(shí)時熒光定量PCR（Real time qPCR）41-44
• 3.8 Western blot44-47
• 3.9 MTT法測細(xì)胞增殖47-48
• 3.10 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)48
• 3.11 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期48-49
• 3.12 細(xì)胞凋亡檢測（Annexin V-APC/PI雙染法）49
• 3.13 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)49-50
• 3.14 統(tǒng)計學(xué)方法50-51
• 4. 結(jié)果51-66
• 4.1 免疫組化分析USP39在黑色素瘤標(biāo)本中的表達(dá)及其與臨床病理資料的相關(guān)性51-53
• 4.2 USP39特異性shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建及其相應(yīng)慢病毒的制備53-56
• 4.3 慢病毒介導(dǎo)的USP39基因表達(dá)沉默對黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響56-62
• 4.4 慢病毒介導(dǎo)的USP39基因表達(dá)沉默對黑色素瘤細(xì)胞增殖抑制作用的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)62-63
• 4.5 USP39對黑色素瘤細(xì)胞增殖影響的機(jī)制研究63-66
• 5. 討論66-75
• 6. 結(jié)論75-76
• 參考文獻(xiàn)76-85
• 附錄85-86
• 致謝86-88
• 綜述88-107
• 參考文獻(xiàn)96-107

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

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本文編號：990706