發(fā)布時間：2017-10-07 19:22

  本文關鍵詞：載4HPR脂質(zhì)微泡的制備及其聯(lián)合超聲對瘢痕疙瘩的作用研究

  更多相關文章： 4HPR 脂質(zhì)體 微泡 超聲 瘢痕疙瘩

【摘要】：目的制備載N-(4-羥基苯基)維生素甲酰胺[N-(4-hydroxyphenyl)retinamide,4HPR]脂質(zhì)微泡(4HPR-loaded lipid microbubbles,4HPR-LM),并探討其聯(lián)合超聲(Ultrasound,US)對瘢痕疙瘩的作用。方法采用薄膜-超聲分散法制備載4HPR脂質(zhì)體(4HPR-loaded liposome,4HPR-L),并采用單因素考察及正交試驗對4HPR-L的制備條件及處方加以優(yōu)化;在4HPR-L的基礎上采用超聲空化法制備4HPR-LM,通過透射電鏡(transmission electron microscopy,TEM)法、動態(tài)光散射法及 HPLC(high-performance liquid chromatograph,HPLC)法,對其外觀形態(tài)、粒徑分布、Zeta電位、包封率、載藥量、物理穩(wěn)定性、溫度及超聲敏感性等制劑學性質(zhì)進行了考察。通過MTT比色實驗對體外實驗超聲參數(shù)進行優(yōu)化,采用激光共聚焦顯微鏡法觀察香豆素-6脂質(zhì)微泡的入胞情況,通過細胞增殖抑制試驗分別評價空白脂質(zhì)微泡(Blank-loaded lipid microbubbles,Blank-LM)的生物相容性及游離 4HPR、單純 4HPR-LM、4HPR-LM聯(lián)合超聲的細胞增殖抑制作用,采用AnnexinV-FITC/PI雙染法和Hoechst33258熒光染色法觀察游離4HPR及4HPR-LM聯(lián)合超聲誘導人瘢痕疙瘩成纖維細胞(Human Keloid Fibroblasts,HKFs)的凋亡情況。建立裸鼠瘢痕疙瘩皮下移植瘤模型,觀察游離4HPR及4HPR-LM聯(lián)合超聲的體內(nèi)抑瘤作用,并對其應用安全性進行評價。結果優(yōu)化實驗確定制備條件為:三氯甲烷2 ml,旋蒸30 min,水浴溫度50℃,轉速120 rpm/min,5%葡萄糖溶液8 ml,旋轉水化溶脹時間20 min,探頭超聲時間5 min,過0.22 μm濾膜次數(shù) 7 次;脂質(zhì)體處方為:EPC:Chol(g:g)為 11:1、4HPR 為 3mg、mPEG-DSPE2000為3 mg:制備的4HPR-L透射電鏡下顯示為大小均勻、外觀圓整的球形或類球形結構:馬爾文粒徑儀檢測顯示平均粒徑為(122.87±5.06)nm,Zeta電位為(-43.8±1.0)mV,密封保存(4℃)30天外觀、平均粒徑和Zeta電位均無明顯變化,7 d、15 d、30 d其滲漏率分別為(1.30±0.89)%、(3.15±0.75)%、(5.88±0.63)%,說明制備的 4HPR-L 4℃冰箱內(nèi)密封保存 30d穩(wěn)定性良好;4HPR-LM平均粒徑為(113.80±3.27)nm,Zeta電位為(-35.5±1.10)mV,包封率為(94.48±1.05)%,載藥量為(8.31±0.33)%,具有一定的溫度及超聲敏感性,為其超聲輻照下體內(nèi)釋藥提供了理論支撐。MTT實驗確定體外實驗超聲參數(shù)設置為3 MHz,0.7 w/cm2,60s;激光共聚焦實驗顯示脂質(zhì)微泡的入胞速度很快,在10 min內(nèi)基本能進入細胞,而超聲輻照能促進入胞作用;細胞增殖抑制試驗顯示在本實驗范圍內(nèi),Blank-LM對HKFs的抑制率均在9.67%以內(nèi),表明載體材料的生物相容性良好;4HPR及4HPR-LM對HKFs的生長增殖作用均表現(xiàn)出濃度及時間依賴性,相比于游離4HPR,4HPR-LM能更有效地抑制HKFs的生長增殖,組間比較有統(tǒng)計學差異(P0.05),而4HPR-LM聯(lián)合超聲輻照相比于游離4HPR及單純4HPR-LM則表現(xiàn)出更強地抑制HKFs的生長增殖作用,各組間比較差異均有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01);細胞凋亡實驗顯示,與游離4HPR相比,4HPR-LM聯(lián)合超聲能更有效地誘導HKFs的凋亡(P0.01)。4HPR-LM聯(lián)合超聲亦較游離4HPR表現(xiàn)出更好地抑制人瘢痕疙瘩組織塊生長的效果(P0.01),所有裸鼠心、肝、脾、腎HE染色均未見明顯器質(zhì)性變化,在整個實驗過程中所有裸鼠一般狀態(tài)均良好,體重無明顯差異,未見明顯不良反應發(fā)生。結論 制備的4HPR-L穩(wěn)定性良好,能對疏水性極強的4HPR進行良好的包封,極大地提高了 4HPR的水溶性,為4HPR的進一步研究奠定了良好的基礎;最終制備的4HPR-LM聯(lián)合超聲輻照在體內(nèi)外實驗中顯示出較好地抑制HKFs生長增殖、誘導凋亡及抑制瘢痕疙瘩生長的作用。4HPR-LM聯(lián)合US是一種有效提高藥物療效的方法,有望成為治療瘢痕疙瘩的一種新途徑,值得進一步深入研究。
【關鍵詞】：4HPR 脂質(zhì)體 微泡 超聲 瘢痕疙瘩
【學位授予單位】：延邊大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 中英文對照表13-14
• 第一章 前言14-16
• 第二章 載4HPR脂質(zhì)體及載4HPR脂質(zhì)微泡的制備與表征16-42
• 第一節(jié) 載4HPR脂質(zhì)體中藥物含量及包封率檢測方法的建立16-23
• 2.1 實驗儀器與材料16
• 2.2 實驗方法16-18
• 2.2.1 HPLC檢測波長的選擇16
• 2.2.2 4HPR含量體外檢測色譜條件16-17
• 2.2.3 4HPR含量測定標準曲線的繪制17
• 2.2.4 專屬性實驗17
• 2.2.5 精密度實驗17
• 2.2.6 4HPR-L包封率檢測方法的建立17-18
• 2.3 實驗結果與討論18-22
• 2.3.1 4HPR紫外掃描結果圖18-19
• 2.3.2 4HPR體外含量測定標準曲線19
• 2.3.3 專屬性實驗19-20
• 2.3.4 精密度實驗20
• 2.3.5 4HPR脂質(zhì)體包封率檢測方法的建立20-22
• 2.4 小結22-23
• 第二節(jié) 載4HPR脂質(zhì)體制備工藝及處方的優(yōu)化23-35
• 2.1 實驗儀器與材料23
• 2.2 實驗方法23-26
• 2.2.1 載4HPR脂質(zhì)體的制備23
• 2.2.2 單因素考察優(yōu)化制備工藝23-24
• 2.2.3 處方的單因素考察24-25
• 2.2.4 處方的正交實驗25
• 2.2.5 工藝重現(xiàn)性考察25-26
• 2.3 實驗結果與討論26-34
• 2.3.1 制備條件的單因素考察26-31
• 2.3.2 處方的單因素考察31-32
• 2.3.3 處方的正交優(yōu)化設計實驗結果32-33
• 2.3.4 工藝重現(xiàn)性33-34
• 2.4 小結34-35
• 第三節(jié) 載4HPR脂質(zhì)體及載4HPR脂質(zhì)微泡的制備及質(zhì)量評價35-42
• 2.1 實驗儀器與材料35
• 2.2 實驗方法35-36
• 2.2.1 4HPR-L的制備35
• 2.2.2 4HPR-LM的制備35
• 2.2.3 4HPR-L與4HPR-LM包封率的對比35
• 2.2.4 4HPR-L與4HPR-LM的表征35-36
• 2.3 實驗結果與討論36-40
• 2.3.1 4HPR-L與4HPR-LM包封率的對比36-37
• 2.3.2 4HPR-L與4HPR-LM的表征37-40
• 2.4 小結40-42
• 第三章 4HPR-LM聯(lián)合超聲對瘢痕疙瘩成纖維細胞的作用研究42-54
• 3.1 實驗儀器與實驗材料42
• 3.2 實驗方法42-45
• 3.2.1 入瘢痕疙瘩成纖維細胞的原代培養(yǎng)42-43
• 3.2.2 細胞傳代43
• 3.2.3 細胞生長曲線43
• 3.2.4 體外實驗超聲參數(shù)的篩選43-44
• 3.2.5 細胞攝取試驗44
• 3.2.6 細胞增殖抑制試驗44
• 3.2.7 細胞凋亡試驗44-45
• 3.2.8 統(tǒng)計學方法45
• 3.3 實驗結果與討論45-53
• 3.3.1 原代培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細胞生長狀況45-46
• 3.3.2 細胞生長曲線46
• 3.3.3 超聲參數(shù)篩選46-47
• 3.3.4 細胞攝取試驗47-48
• 3.3.5 細胞增殖抑制試驗48-51
• 3.3.6 細胞凋亡試驗51-53
• 3.4 小結53-54
• 第四章 4HPR-LM聯(lián)合超聲對瘢痕疙瘩裸鼠皮下移植瘤的作用研究54-58
• 4.1 實驗儀器和實驗材料54
• 4.2 實驗方法54-55
• 4.2.1 瘢痕疙瘩裸鼠皮下移植瘤模型的建立54
• 4.2.2 4HPR-LM聯(lián)合超聲體內(nèi)抑制瘢痕疙瘩生長作用及初步安全性評價54
• 4.2.3 統(tǒng)計學方法54-55
• 4.3 實驗結果和討論55-57
• 4.3.1 瘢痕疙瘩裸鼠皮下移植瘤模型的評估55
• 4.3.2 瘢痕疙瘩裸鼠皮下移植瘤塊體積變化55-56
• 4.3.3 瘢痕疙瘩裸鼠皮下移植瘤塊組織學變化56
• 4.3.4 初步安全性評價56-57
• 4.4 小結57-58
• 第五章 結論58-59
• 參考文獻59-64
• 致謝64-65
• 綜述65-74
• 參考文獻70-74

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