本文關(guān)鍵詞：光老化人真皮成纖維細(xì)胞通過“旁觀者效應(yīng)”對(duì)正常人真皮成纖維細(xì)胞氧化損害、增殖、老化及自噬活性的影響

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【摘要】：研究背景皮膚的老化是由內(nèi)源性和外源性因素決定的,外源性因素如太陽(yáng)輻射、吸煙或污染,其中太陽(yáng)輻射占主要作用,故常將外源性因素引起的老化稱為光老化。體外培養(yǎng)的正常細(xì)胞經(jīng)過紫外線照射等應(yīng)激刺激可出現(xiàn)提早衰老稱為應(yīng)激誘導(dǎo)的提前衰老(Stress-induced premature senescence,SIPS)。我們及國(guó)內(nèi)外等多個(gè)研究小組均通過連續(xù)多次中波紫外線(Ultraviolet B,UVB)照射HDFs成功構(gòu)建了UVB誘導(dǎo)的提前衰老細(xì)胞模型(UVB-SIPS)。放射學(xué)家將直接受損傷細(xì)胞將所受損害傳播至其他沒有直接受損細(xì)胞的現(xiàn)象稱為旁觀者效應(yīng)。近些年來(lái),已有多名學(xué)者證明,經(jīng)紫外線單次照射的人真皮成纖維細(xì)胞(Human dermal fibroblasts,HDFs)通過旁觀者效應(yīng)使周圍成纖維細(xì)胞發(fā)生諸如增殖活性降低、DNA損傷、周期阻滯等各種生物學(xué)表現(xiàn)。然而,對(duì)于光老化人真皮成纖維細(xì)胞能否通過旁觀者效應(yīng)影響其周圍正常人真皮成纖維細(xì)胞尚未見報(bào)道。目的研究光老化人真皮成纖維細(xì)胞能否通過“旁觀者效應(yīng)”對(duì)正常人真皮成纖維細(xì)胞的增殖、老化及自噬等產(chǎn)生影響及其機(jī)制。方法1.HDFs的分離與培養(yǎng)從本院泌尿外科手術(shù)室獲取健康青壯年男性包皮環(huán)切術(shù)后的組織后分離表真皮,對(duì)獲得的HDFs正常培養(yǎng),取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4~10代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。2.uvb-sips造模將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的4~10代hdfs進(jìn)行每天1次10mj/cm2uvb照射,連續(xù)照射5天后,靜置3天。3.細(xì)胞培養(yǎng)上清液的收集正常培養(yǎng)2-3天未經(jīng)處理的hdfs及光老化hdfs后,分別收集各組培養(yǎng)上清液,即正常成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液(conditionedmediumofnormalfibroblasts,fb-cm)及uvb誘導(dǎo)的提前衰老的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液(conditonedmediumofphotoagingfibroblasts,ph-cm),收集后放入-80℃冰箱中備用。4.ph-cm對(duì)hdfs的氧化損害將ph-cm孵育正常hdfs4天后,使用細(xì)胞熒光染色法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞中活性氧及線粒體膜電位的水平。5.ph-cm對(duì)hdfs增殖的影響將ph-cm孵育正常hdfs20天后,使用cck-8法及edu染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期。6.ph-cm對(duì)hdfs提前衰老的影響將ph-cm孵育正常hdfs20天后,使用衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(senesceneassociated-β-galactosidase,sa-β-gal)化學(xué)染色法檢測(cè)細(xì)胞衰老。7.ph-cm對(duì)hdfs自噬活性的影響將ph-cm孵育正常hdfs20天后,使用吖啶橙染色法檢測(cè)細(xì)胞自噬水平、細(xì)胞免疫熒光染色法及蛋白質(zhì)印跡法(westernblot,wb)檢測(cè)細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白lc3-b的表達(dá)。結(jié)果1.ph-cm可加劇hdfs的氧化損害細(xì)胞熒光染色法及流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示:ph-cm孵育組培養(yǎng)體系中的hdfs的活性氧水平及線粒體膜電位去極化水平均高于fb-cm孵育組,兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。培養(yǎng)基中加入抗氧化劑n-乙酰-l-半胱氨酸(nacetyllcysteine,nac)可減輕ph-cm對(duì)hdfs的氧化損害。2.ph-cm可抑制hdfs增殖cck-8結(jié)果顯示ph-cm孵育組細(xì)胞增殖活性較fb-cm孵育組明顯下降,兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);細(xì)胞周期結(jié)果顯示ph-cm組g1期細(xì)胞百分比明顯低于對(duì)照組,兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);EDU染色結(jié)果提示PH-CM組S期細(xì)胞百分比明顯高于對(duì)照組,兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.PH-CM可加速HDFs衰老表型PH-CM孵育組中HDFs的SA-β-Gal染色陽(yáng)性率明顯高于FB-CM孵育組,兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.PH-CM可抑制HDFs自噬吖啶橙染色結(jié)果顯示PH-CM孵育組HDFs自噬小泡熒光量低于FB-CM孵育組,兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Western印跡及細(xì)胞免疫熒光結(jié)果均顯示PH-CM孵育組中HDFs的LC3-B表達(dá)量低于對(duì)照組,兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論光老化人真皮細(xì)胞可通過“旁觀者效應(yīng)”加劇正常人真皮成纖維細(xì)胞氧化損害導(dǎo)致后者增殖減緩、老化加速及自噬減少。
【關(guān)鍵詞】：中波紫外線 旁觀者效應(yīng) 氧化損害 增殖 自噬
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R751
【目錄】：

• 全文主要縮略語(yǔ)4-5
• 全文技術(shù)流程圖5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 材料與方法16-33
• 結(jié)果33-40
• 討論40-45
• 全文小結(jié)45-46
• 參考文獻(xiàn)46-49
• 綜述49-56
• 參考文獻(xiàn)53-56
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況56-57
• 致謝57-58

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1 覃冬云;吳鐵;廖蕓蕓;王勤;;煙清含片對(duì)長(zhǎng)期熏煙小鼠氣道炎癥及過氧化損害的影響[J];中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志;2008年08期

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本文編號(hào)：949405