本文關(guān)鍵詞：光老化人真皮成纖維細胞通過“旁觀者效應(yīng)”對正常人真皮成纖維細胞氧化損害、增殖、老化及自噬活性的影響

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【摘要】：研究背景皮膚的老化是由內(nèi)源性和外源性因素決定的,外源性因素如太陽輻射、吸煙或污染,其中太陽輻射占主要作用,故常將外源性因素引起的老化稱為光老化。體外培養(yǎng)的正常細胞經(jīng)過紫外線照射等應(yīng)激刺激可出現(xiàn)提早衰老稱為應(yīng)激誘導(dǎo)的提前衰老(Stress-induced premature senescence,SIPS)。我們及國內(nèi)外等多個研究小組均通過連續(xù)多次中波紫外線(Ultraviolet B,UVB)照射HDFs成功構(gòu)建了UVB誘導(dǎo)的提前衰老細胞模型(UVB-SIPS)。放射學家將直接受損傷細胞將所受損害傳播至其他沒有直接受損細胞的現(xiàn)象稱為旁觀者效應(yīng)。近些年來,已有多名學者證明,經(jīng)紫外線單次照射的人真皮成纖維細胞(Human dermal fibroblasts,HDFs)通過旁觀者效應(yīng)使周圍成纖維細胞發(fā)生諸如增殖活性降低、DNA損傷、周期阻滯等各種生物學表現(xiàn)。然而,對于光老化人真皮成纖維細胞能否通過旁觀者效應(yīng)影響其周圍正常人真皮成纖維細胞尚未見報道。目的研究光老化人真皮成纖維細胞能否通過“旁觀者效應(yīng)”對正常人真皮成纖維細胞的增殖、老化及自噬等產(chǎn)生影響及其機制。方法1.HDFs的分離與培養(yǎng)從本院泌尿外科手術(shù)室獲取健康青壯年男性包皮環(huán)切術(shù)后的組織后分離表真皮,對獲得的HDFs正常培養(yǎng),取處于對數(shù)生長期的4~10代細胞進行實驗。2.uvb-sips造模將處于對數(shù)生長期的4~10代hdfs進行每天1次10mj/cm2uvb照射,連續(xù)照射5天后,靜置3天。3.細胞培養(yǎng)上清液的收集正常培養(yǎng)2-3天未經(jīng)處理的hdfs及光老化hdfs后,分別收集各組培養(yǎng)上清液,即正常成纖維細胞培養(yǎng)上清液(conditionedmediumofnormalfibroblasts,fb-cm)及uvb誘導(dǎo)的提前衰老的成纖維細胞培養(yǎng)上清液(conditonedmediumofphotoagingfibroblasts,ph-cm),收集后放入-80℃冰箱中備用。4.ph-cm對hdfs的氧化損害將ph-cm孵育正常hdfs4天后,使用細胞熒光染色法和流式細胞術(shù)檢測細胞中活性氧及線粒體膜電位的水平。5.ph-cm對hdfs增殖的影響將ph-cm孵育正常hdfs20天后,使用cck-8法及edu染色法檢測細胞增殖活性,流式細胞術(shù)檢測細胞周期。6.ph-cm對hdfs提前衰老的影響將ph-cm孵育正常hdfs20天后,使用衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶(senesceneassociated-β-galactosidase,sa-β-gal)化學染色法檢測細胞衰老。7.ph-cm對hdfs自噬活性的影響將ph-cm孵育正常hdfs20天后,使用吖啶橙染色法檢測細胞自噬水平、細胞免疫熒光染色法及蛋白質(zhì)印跡法(westernblot,wb)檢測細胞自噬相關(guān)蛋白lc3-b的表達。結(jié)果1.ph-cm可加劇hdfs的氧化損害細胞熒光染色法及流式細胞術(shù)結(jié)果提示:ph-cm孵育組培養(yǎng)體系中的hdfs的活性氧水平及線粒體膜電位去極化水平均高于fb-cm孵育組,兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義(p0.05)。培養(yǎng)基中加入抗氧化劑n-乙酰-l-半胱氨酸(nacetyllcysteine,nac)可減輕ph-cm對hdfs的氧化損害。2.ph-cm可抑制hdfs增殖cck-8結(jié)果顯示ph-cm孵育組細胞增殖活性較fb-cm孵育組明顯下降,兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義(p0.05);細胞周期結(jié)果顯示ph-cm組g1期細胞百分比明顯低于對照組,兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);EDU染色結(jié)果提示PH-CM組S期細胞百分比明顯高于對照組,兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3.PH-CM可加速HDFs衰老表型PH-CM孵育組中HDFs的SA-β-Gal染色陽性率明顯高于FB-CM孵育組,兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.PH-CM可抑制HDFs自噬吖啶橙染色結(jié)果顯示PH-CM孵育組HDFs自噬小泡熒光量低于FB-CM孵育組,兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);Western印跡及細胞免疫熒光結(jié)果均顯示PH-CM孵育組中HDFs的LC3-B表達量低于對照組,兩組數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論光老化人真皮細胞可通過“旁觀者效應(yīng)”加劇正常人真皮成纖維細胞氧化損害導(dǎo)致后者增殖減緩、老化加速及自噬減少。
【關(guān)鍵詞】：中波紫外線 旁觀者效應(yīng) 氧化損害 增殖 自噬
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R751
【目錄】：

• 全文主要縮略語4-5
• 全文技術(shù)流程圖5-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 材料與方法16-33
• 結(jié)果33-40
• 討論40-45
• 全文小結(jié)45-46
• 參考文獻46-49
• 綜述49-56
• 參考文獻53-56
• 攻讀學位期間發(fā)表文章情況56-57
• 致謝57-58

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本文編號：949405