本文關(guān)鍵詞：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3在水痘—帶狀皰疹病毒復(fù)制過程中的作用和機制研究

  更多相關(guān)文章： 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3 微小RNA-21 Ⅰ型IFN 水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)

【摘要】：研究背景和目的水痘-帶狀皰疹病毒(varicella-zoster virus, VZV)屬皰疹病毒α亞科,是雙鏈DNA病毒。人類對VZV普遍易感,VZV主要是通過呼吸道和密切接觸傳播,感染后可以引起水痘和帶狀皰疹兩種截然不同的疾病。VZV初次感染后病毒并不能被機體完全清除,而是潛伏在脊髓神經(jīng)節(jié)或三叉神經(jīng)節(jié)的感覺神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)。在機體免疫力低下時可被再次激活從而引發(fā)帶狀皰疹,臨床以沿單側(cè)肢體分布的紅斑水皰伴有疼痛為特征。部分患者可出現(xiàn)嚴(yán)重疼痛甚至后遺神經(jīng)痛。水痘及帶狀皰疹為臨床常見病。然而,作為VZV發(fā)病機制重要組成的一部分,VZV復(fù)制機制的研究至今仍然較為匱乏。微小RNA (microRNA, miRNA)在基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達,是一類長度為21～24 (nucleotide, nt)的非編碼小RNA,參與了多種生物學(xué)信號通路的調(diào)節(jié)。miRNA可以控制多種生物進程,如細(xì)胞的增殖,凋亡和分化。越來越多的證據(jù)表明,miRNA的異常表達參與了腫瘤的發(fā)生,發(fā)展。除此之外,miRNA在影響病毒復(fù)制方面,許多研究證明mi RNA具有不同的作用和影響。miR-181抑制呼吸綜合征病毒；miR-17-29干擾HBV而miR-501增強HBV的產(chǎn)生,而不是抑制復(fù)制,兩者間的關(guān)系就像相同組織中miR-126和柯薩奇病毒之間相互作用的關(guān)系。然而,至今只有少量研究關(guān)于miRNA與VZV復(fù)制之間的關(guān)系。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子家族(signal transducerand activaye of transcription, Stats)是一類由生長因子、細(xì)胞因子等多肽類配體激活的轉(zhuǎn)錄因子。共有7個成員,其中stat3是較為活躍的一個。Stat3是一種具有致癌潛能的轉(zhuǎn)錄因子。Stat3有7個主要部分：①保守的氨基端序列,為Stat3和其他轉(zhuǎn)錄因子之間相互作用、Stat3二聚體的形成以及和細(xì)胞因子受體間結(jié)合等所必需；②位于727位的絲氨酸磷酸化位點,可激活Stat3,使STAT途徑與Ras途徑產(chǎn)生相互聯(lián)系；③位于羧基端第705位的酪氨酸磷酸化位點,該位點磷酸化以后可使Stat3活化,移入細(xì)胞核以后可以激活靶基因的轉(zhuǎn)錄；④位于第400-500位氨基酸之間DNA結(jié)合區(qū),為高度保守；⑤羧基端,該區(qū)域有兩種不同的剪接方式,形成了Stat3α和Stat3β,這一區(qū)域含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū)；⑥位于第500-600位氨基酸之間保守性較差的SH3區(qū),功能尚不清楚；⑦位于第600-700位氨基酸之間的SH2區(qū),其功能是促使Stat3分子與活化的受體形成復(fù)合物,介導(dǎo)Ja-nus激酶-STAT間的相互作用,使Stat3形成二聚體,移入細(xì)胞核,調(diào)節(jié)基因表達。在生理狀態(tài)下,Stat3的激活是快速并且短暫的,對生理功能起著關(guān)鍵性作用。病理狀態(tài)下,Stat3屬于一種致癌基因,具有強烈的抑制細(xì)胞凋亡,促進細(xì)胞增殖的作用。此外,Stat3在病毒發(fā)病機制中起重要作用,如γ-皰疹,卡波西肉瘤皰疹病毒(KSHV),以及Epstein-Barr病毒(EBV)。最近研究發(fā)現(xiàn),VZV觸發(fā)Stat3信號傳導(dǎo)途徑,并且根據(jù)抗凋亡蛋白生存素依賴機制激活的Stat3增加VZV復(fù)制。干擾素(inteferin, IFNs)是一種重要的抗病毒免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子,按照其來源和功能,可將其分為三類。IFN-Ⅰ包括IFN-α和IFN-β,可產(chǎn)生于大部分類型細(xì)胞中,具有抗病毒活性。IFN-ω、ε、κ、δ和τ也屬于Ⅰ型干擾素,但它們的表達依細(xì)胞類型和物種特異性而不同。Ⅰ型干擾素通過受體IFNAR1/2向胞內(nèi)傳遞信號。Ⅰ型干擾素參與誘導(dǎo)多條信號通路,如Jak—Stat途徑,CRKL途徑；PI3K途徑；MAPK途徑。很多病毒對Ⅰ型干擾素非常敏感,Ⅰ型干擾素可以在病毒復(fù)制的任何階段發(fā)揮作用。Ⅰ型干擾素抗病毒的功能是通過干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生的功能蛋白因子來實現(xiàn)的,其中研究較多的包括PKR,ADAR,OAS (2c,5c-oligoadenylate synthetase),RNase L以及Mx。除了干擾素誘導(dǎo)的抗病毒蛋白之外,Ⅰ型干擾素也能夠通過調(diào)節(jié)諸如NK細(xì)胞、T細(xì)胞等重要的免疫細(xì)胞來發(fā)揮功能。根據(jù)上述研究基礎(chǔ),我們推測在VZV感染的情況下,是否存在VZV、miRNA. Stat3及IFN四者之間的某種聯(lián)系。這是一個值得研究的課題,其意義在于探究VZV復(fù)制的機制,可以于患病早期,尤其是對于老年帶狀皰疹患者可給與積極治療,以減輕后遺神經(jīng)痛的發(fā)病,為臨床治療提供新的思路。方法(1)在人胚肺成纖維細(xì)胞(HELF)細(xì)胞株中感染VZV病毒,與未感染者進行對比,使用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法(qRT-PCR)進行測定,比較micro RNA-21、Stat3及抗凋亡蛋白存活素(survivn)的表達情況。(2)在VZV感染的HELF中,按照OnM、25nM、50 nM、00 nM、 200 nM的濃度逐級遞增microRNA-21模擬物,利用空斑病毒檢測法檢測VZV病毒滴度。(3)在HELF細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染microRNA-21模擬物,同時對部分樣本轉(zhuǎn)染miR-對照,使用qRT-PCR方法,利用GAPDH作為內(nèi)部參照,檢測Stat3和survivn的mRNA表達情況。(4)在HELF細(xì)胞感染VZV后,將microRNA-21的模擬物和沉默Stat3基因轉(zhuǎn)染HELF細(xì)胞。本實驗分為4組,分別命名為21+shStat3(細(xì)胞共轉(zhuǎn)染+microRNA-21的模擬物+Stat3沉默基因)、21+shcontrol(細(xì)胞共轉(zhuǎn)染-mi RNA-21-模擬物和+對照沉默基因), micro對照+ shSTAT3(細(xì)胞共轉(zhuǎn)染+ miRNA對照+Stat3沉默基因),micro對照+shcontrol(細(xì)胞共轉(zhuǎn)染+ miRNA對照+-對照沉默基因)。Stat3蛋白的表達通過Western blotting (WB)方法檢測(以判斷Stat3是否有效被沉默),觀察組間microRNA-21表達情況,及病毒滴度的變化。(5)VZV感染HELF細(xì)胞,應(yīng)用WB方法檢測Stat3的表達；(6)通過對感染VZV的HELF細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒,形成Stat3過表達組及Stat3沉默組,使用空斑病毒滴度檢測法分別檢測未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組(VZV+HELF)及上述兩組(VZ V+HELF+upSTAT3組和VZV+HELF+siSTAT3組)的VZV滴度,并用qRT-PCR檢測IFN-Ⅰ的功能蛋白(OAS、PKR、IRF3和STAT1)的表達情況。(7)在VZV+HELF,VZV+HELF+upSTAT3組和VZV+HELF+siSTAT3三組中,分別按照0,25,50, 100U/ml加入IFN,檢測VZV滴度。在三組中,分別加入25ng/ml的IFN Ab,檢測VZV滴度。結(jié)果(1)microRNA-21的表達水平在HELF細(xì)胞株感染VZV后上調(diào)(p=0.000)；感染組Stat3的相對mRNA表達高于未感染組(P=0.000)。(2)在HELF細(xì)胞中,病毒滴度隨microRNA-21模擬物濃度的增高而增高,兩者呈正相關(guān)。但當(dāng)microRNA-21模擬物在200nM的濃度時,病毒滴度沒有顯著增加。(3)在轉(zhuǎn)染microRNA-21的模擬物的HELF細(xì)胞中,Stat3的mRNA表達(P=0.000)和survivn(P=0.000)水平都得到提高。(4) microRNA-21在21+shStat3和21+shcontrol兩組中具有較高的表達,明顯優(yōu)于其他兩組；在21+shStat3和對照+shStat3兩組中,Stat3蛋白的表達量極低,說明Stat3有效被沉默。4個組中病毒平均滴度分別為3.47×102 PFU/ml (21+shStat3),1.48×107PFU/ml (21+shcontrol),1.82×102 PFU/ml(對照+shStat3),3.23×104PFU/ml(對照+shcontrol)。miR-21的過度表達刺激VZV的復(fù)制,直到Stat3基因沉默。(5)VZV感染后,Stat3表達顯著。Stat3的過度表達增加了VZV感染(upSTAT3 VS upcontrol, P0.001),同時,干擾素反應(yīng)基因(OAS (P=0.000), PKR (P =0.000), IRF3 (P=0.000)和STAT1 (P=0.000))在upSTAT3中都有衰減。(6)VZV感染HELF后24小時,沉默Stat3組病毒滴度顯著降低(p=0.007),且Ⅰ型IFN反應(yīng)基因OAS (P=0.000), PKR (P=0.000)、IRF3 (P=0.000)和STAT1 (P=0.000)上調(diào)。(7)在正常HELF細(xì)胞和Stat3沉默細(xì)胞中,干擾素以一種劑量依賴(0,25,50,100U/ml)的方式降低VZV復(fù)制。用25ng/ml的干擾素抗體處理細(xì)胞時,VZV效價達到很高的水平。結(jié)論1) microRNA-21、Stat3均可促進VZV復(fù)制,microRNA-21過表達可上調(diào)Stat3,促進VZV的復(fù)制。2) Stat3基因過表達可以顯著抑制IFN-Ⅰ對VZV感染的作用。沉默Stat3時,IFN-Ⅰ對VZV感染的反應(yīng)增強。Stat3在VZV感染過程中抑制IFN-Ⅰ介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)。3) Stat3可通過抑制IFN-1介導(dǎo)的抗病毒反應(yīng)促進VZV復(fù)制,同時microRNA-21可上調(diào)Stat3基因的表達,microRNA-21、Stat3二者在病毒感染過程中協(xié)同促進VZV復(fù)制。
【關(guān)鍵詞】：信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3 微小RNA-21 Ⅰ型IFN 水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R752.12;R511.5
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-15
• 前言15-20
• 第一章 微小RNA-21通過觸發(fā)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3影響水痘-帶狀皰疹病毒20-56
• 1. 材料、試劑、儀器20-27
• 2. 實驗方法27-39
• 3. 結(jié)果39-46
• 4. 討論46-49
• 結(jié)論與展望49-51
• 參考文獻51-56
• 第二章 STAT3抑制VZV感染誘導(dǎo)的Ⅰ型干擾素反應(yīng)56-77
• 1. 材料、試劑、儀器60-67
• 2. 實驗方法67-69
• 3. 結(jié)果69-75
• 4. 討論75-77
• 全文總結(jié)77-78
• 參考文獻78-82
• 綜述一 Stat3與相關(guān)皮膚病研究進展82-91
• 參考文獻88-91
• 綜述二 MicroRNA與腫瘤91-100
• 參考文獻96-100
• 縮寫詞簡表100-101
• 致謝101-102
• 博士研究生期間發(fā)表論文情況102-103

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