本文關(guān)鍵詞：緩激肽B1受體在慢性炎性皮損區(qū)癢感覺中的作用

  更多相關(guān)文章： 慢性瘙癢 緩激肽B1受體 角質(zhì)形成細(xì)胞 HaCaT細(xì)胞株

【摘要】：研究背景及目的癢所描述的是一種引起機(jī)體產(chǎn)生抓撓欲望的不愉快感覺,其被認(rèn)為是機(jī)體的一種自我防護(hù)反應(yīng)。最近的研究表明：癢是一種獨(dú)立于痛溫觸壓覺之外的軀體感覺,同時(shí),神經(jīng)纖維與非神經(jīng)纖維的細(xì)胞共同參與異常癢感覺的發(fā)生發(fā)展,這種觀點(diǎn)逐漸受到人們的關(guān)注。皮膚作為機(jī)體最大感受器官,有密集的感覺神經(jīng)纖維分布,是各種機(jī)體感受的初始階段。特應(yīng)性皮炎患者伴有難治性的瘙癢感覺,該癥狀與患者局部皮損區(qū)慢性炎性微環(huán)境息息相關(guān)。慢性全身性疾病如腎臟疾病、肝臟疾病、膽道疾病、惡性腫瘤或艾滋病等也常伴隨慢性難治性瘙癢,該癥狀應(yīng)用傳統(tǒng)抗組胺藥物治療無效。慢性癢感覺與急性瘙癢感覺不同,搔抓行為不能減輕其瘙癢感受,反而可以誘發(fā)瘙癢感覺,從而形成“瘙癢-搔抓-瘙癢”惡性循環(huán)加重瘙癢感覺。課題組前期研究觀察到在痛敏研究常用CFA模型中,局部皮損區(qū)應(yīng)用致痛物質(zhì)緩激肽誘發(fā)小鼠搔抓反應(yīng),且小鼠搔抓反應(yīng)不能為應(yīng)用嗎啡所減弱,緩激肽B1受體參與此異常癢感覺的調(diào)節(jié)。同時(shí),TRPV1抑制劑辣椒平對緩激肽在CFA炎性皮損區(qū)引起的異常癢感覺并沒有明顯影響,認(rèn)為CFA炎性皮損區(qū)緩激肽引起瘙癢發(fā)生機(jī)制與其他機(jī)制所引起瘙癢不同。特應(yīng)性皮炎患者血漿和組織激肽釋放酶水平增加,這兩種酶可使無活性的激肽原釋放出活性激肽,包括緩激肽和胰激肽。緩激肽是肽類物質(zhì),不能透過細(xì)胞膜,需要與細(xì)胞膜上特異性受體結(jié)合才能發(fā)揮生物學(xué)作用。通常情況下,緩激肽對B2R具有激活作用,但必須通過羧肽酶作用水解為des-Arg(9)-bradykinin或者des-Arg(10)-kallidin才能激活B1受體。緩激肽是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)重要的炎性肽,是目前已知的最強(qiáng)致痛物質(zhì)及重要的炎癥介導(dǎo)因子,同時(shí)也有研究認(rèn)為其可參與多種生物活性物質(zhì)的調(diào)節(jié),或是直接激活或間接增敏TRPV1通道。緩激肽作用于激肽B1受體(kinin B1 Receptor, B1R)和激肽B2受體(kinin B2 Receptor, B2R),都是細(xì)胞型G蛋白偶聯(lián)受體,B2R為組成性表達(dá),激活后很快內(nèi)化失活,B1R在正常生理狀態(tài)下除在中樞神經(jīng)系統(tǒng)組成性表達(dá)以外幾乎不表達(dá),而在白介素、細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、創(chuàng)傷、炎癥等多種情況下誘導(dǎo)而快速產(chǎn)生,是一種可誘導(dǎo)性受體,能被持續(xù)激活而不失活。那緩激肽受體是否參與慢性炎性環(huán)境慢性自發(fā)性瘙癢感覺形成,其不同受體在該過程中的意義有待說明。我們選擇關(guān)于慢性癢感覺研究常用的二苯基環(huán)丙烯酮(diphenylcyclopropenone DCP)引起的接觸性皮炎模型,觀察探究緩激肽受體在慢性炎性自發(fā)性瘙癢中的可能調(diào)節(jié)形式及機(jī)制。研究方法本研究均選用雄性SPF級C57BL/6J小鼠,鼠齡5～6周齡,體重20～25g,購置于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(中國,佛山)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用及處理方法均符合廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的要求,并嚴(yán)格按照規(guī)定減少動(dòng)物痛苦,盡可能減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用數(shù)量。小鼠于實(shí)驗(yàn)前在七氟醚麻醉下頸背部皮膚剃毛,分別于第一天及第七天在頸背部剃毛區(qū)域局部涂抹1%DCP 0.1ml(或者溶劑丙酮對照組),之后進(jìn)行行為學(xué)觀察,觀察前放置于透明塑料盒(22cm×12cm×10cm)內(nèi)預(yù)適應(yīng)30min,觀察時(shí)間為30min,一只動(dòng)物只做一次實(shí)驗(yàn)。首先對模型構(gòu)建評價(jià)。成功建立小鼠頸背部慢性炎癥自發(fā)性瘙癢模型后,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)觀察小鼠自發(fā)性瘙癢情況后選擇DCP涂抹后第十天,將小鼠于實(shí)驗(yàn)前30min給予B1R拮抗劑/B2R拮抗劑/蛋白酶抑制劑。C57小鼠在行為學(xué)觀察后,在七氟醚麻醉后取頸背部炎性皮損區(qū)(或者丙酮對照組)全層皮膚,蛋白表達(dá)量檢測的部分離體后立即放入液氮中保存過夜再放入.80℃長期保存；mRNA表達(dá)水平檢測的標(biāo)本離體后采用以DEPC水去RNA酶處理后的組織,剪切至長度約3-5mm組織塊,即用RNALater完全浸沒后,4℃過夜,棄去RNALater后.80℃長期保存。之后用于檢測Bdkrb1蛋白及mRNA表達(dá)水平。用于原位組織染色的標(biāo)本在行為學(xué)觀察后,在七氟醚麻醉后以4%多聚甲醛溶液進(jìn)行心臟灌注,灌注成功約10分鐘左右,取頸背部炎性皮損區(qū)(或者丙酮對照組)全層皮膚投入4%多聚甲醛中常溫固定過夜。再取出皮膚標(biāo)本進(jìn)行脫水處理及石蠟包埋,切片,恒溫箱中45℃拷片過夜或60℃ 2小時(shí)后行原位組織染色。為進(jìn)一步研究B1R在角質(zhì)形成細(xì)胞的功能,進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)PAR1及PAR2受體的人HaCaT細(xì)胞株,觀察PAR2受體激活B1R的表達(dá)變化,并對其可能機(jī)制進(jìn)行探索。同時(shí)評價(jià)B1R對HaCaT細(xì)胞增殖與分化功能的影響。結(jié)果1.DCP炎性皮損區(qū)可引起自發(fā)性搔抓行為DCP局部涂抹能夠建立穩(wěn)定的皮膚接觸性皮炎模型,包括出現(xiàn)皮膚紅斑,繼而產(chǎn)生毛囊增生等。本研究亦利用DCP這一特性在小鼠頸背部局部涂抹,使其產(chǎn)生慢性炎癥及自發(fā)性搔抓。分別于第一天及第七天在兩組小鼠頸背部局部涂抹DCP,小鼠頸背部二次局部涂抹DCP后,可在DCP涂抹后一天產(chǎn)生自發(fā)性搔抓行為,在二次涂抹后第一天(開始涂抹第8天)產(chǎn)生強(qiáng)而密集的自發(fā)性搔抓,到第十天達(dá)到高峰,30分鐘內(nèi)自發(fā)性搔抓次數(shù)達(dá)到168±53.48次,隨后隨著時(shí)間的推移遞減。因此,為研究DCP模型自發(fā)性瘙癢的發(fā)生機(jī)制,我們均在DCP涂抹后第十天進(jìn)行本研究其他各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。2.B1R參與DCP模型小鼠炎性皮損區(qū)自發(fā)性搔抓行為DCP應(yīng)用后第十天的小鼠分別腹腔注射選擇性B1R拮抗劑、B2R拮抗劑,劑量同本課題組CFA模型,或者激肽釋放酶抑制劑,給藥30min后持續(xù)觀察小鼠的搔抓反應(yīng)。與對照組相比,全身應(yīng)用激肽釋放酶抑制劑顯著抑制DCP動(dòng)物模型自發(fā)性瘙癢行為,9.83±11.92次(P=0.0208,圖1.2,表1.2),10mg/kg的B1R拮抗劑全身用藥可使小鼠30min內(nèi)的搔抓次數(shù)從113.1±86.3 1減少至30.33±34.93次,而B2R抑制劑對該動(dòng)物模型的自發(fā)性搔抓反應(yīng)無明顯影響。3.B1R在DCP模型局部皮損區(qū)表達(dá)增加在C57小鼠頸背部DCP炎性模型,小鼠的自發(fā)性搔抓行為及相關(guān)藥物處理行為學(xué)數(shù)據(jù)顯示B1R參與炎性皮損區(qū)自發(fā)性癢感覺發(fā)生過程,但B1R在炎性皮損區(qū)的表達(dá)量未定性定量評價(jià),故應(yīng)用分子生物學(xué)相關(guān)方法進(jìn)一步研究B1R在炎性皮損區(qū)的表達(dá)量。檢測DCP模型炎性皮損區(qū)皮膚組織B1R的mRNA及蛋白表達(dá)水平及組織原位表達(dá)情況。Western Blot、Q-PCR檢測B1R表達(dá)水平可見B1R蛋白及mRNA水平表達(dá)上調(diào),B1R蛋白免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示,B1R蛋白在DCP模型組小鼠皮膚組織中表達(dá)升高,強(qiáng)陽性信號(hào)主要分布于表皮基底層到棘細(xì)胞層及真皮的部分細(xì)胞。4.DCP模型小鼠皮損組織,B1R主要表達(dá)于角質(zhì)形成細(xì)胞,而非末梢神經(jīng)纖維。已有實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明B1R在正常神經(jīng)系統(tǒng)固有表達(dá),那在外周組織中,在感覺形成的初始階段,B1R是否表達(dá)于神經(jīng)末梢直接參與感覺形成仍不清楚。我們應(yīng)用免疫熒光雙染技術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)：B1R與PGP9.5不具有明顯共定位信號(hào)。5.激活人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞株P(guān)AR2受體,B1R的表達(dá)增加,可能機(jī)制是通過激活NF-κB通路動(dòng)物模型結(jié)果提示B1R直接參與DCP慢性炎性模型中動(dòng)物的搔抓行為,進(jìn)一步定位分析提示B1R在小鼠皮膚上皮基底層到棘細(xì)胞層表達(dá)量較高。為進(jìn)一步分析B1R在上皮分布的意義,根據(jù)組織定位分析中的結(jié)果提示,我們培養(yǎng)固定表達(dá)PAR1及PAR2受體的人HaCaT細(xì)胞株,PAR2受體激動(dòng)劑(SLIGKV-NH2 100 μM)預(yù)處理HaCaT細(xì)胞24小時(shí),B1R的基因轉(zhuǎn)錄及蛋白水平表達(dá)量均增加,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。之后,應(yīng)用NF-κB通路抑制劑PDTC(25州)可顯著減少PAR2受體激動(dòng)劑預(yù)處理所致的B1R升高,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示PAR2受體激動(dòng)劑可以通過NF-κB通路參與B1R的表達(dá)調(diào)控,進(jìn)一步參與慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展。PAR2受體激動(dòng)劑預(yù)處理HaCaT細(xì)胞,B1R拮抗劑(R892)并未影響上皮分化相關(guān)蛋白filaggrin的轉(zhuǎn)錄水平,同時(shí)對該細(xì)胞株的增殖功能也沒有明顯影響。在該細(xì)胞株中瞬時(shí)轉(zhuǎn)染BDKRB1,同時(shí)使用B1R激動(dòng)劑預(yù)處理也得到相同的結(jié)果,也即B1R激活不影響HaCaT細(xì)胞增殖與分化功能。結(jié)論1.B1R參與DCP模型小鼠炎性皮損區(qū)自發(fā)性搔抓行為；2.DCP模型小鼠局部皮損區(qū),B1R表達(dá)增加；3.DCP模型小鼠局部皮損區(qū),B1R主要表達(dá)于角質(zhì)形成細(xì)胞,而非末梢神經(jīng)纖維上；4.在人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞株,PAR2受體激動(dòng)劑通過NF-κB通路參與B1R的表達(dá)調(diào)控,B1R激活不直接影響HaCaT細(xì)胞增殖與分化功能。
【關(guān)鍵詞】：慢性瘙癢 緩激肽B1受體 角質(zhì)形成細(xì)胞 HaCaT細(xì)胞株
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R758.31
【目錄】：

• 摘要3-8
• ABSTRACT8-14
• 前言14-21
• 第一章 緩激肽B1受體在DCP模型中的表達(dá)增加21-44
• 引言21-22
• 1 材料22-26
• 2 方法26-34
• 3 結(jié)果與分析34-40
• 4 討論40-43
• 5 結(jié)論43-44
• 第二章 緩激肽B1受體在角質(zhì)形成細(xì)胞的表達(dá)及意義44-55
• 引言44-45
• 1 材料45-46
• 2 方法46-49
• 3 結(jié)果與分析49-52
• 4 討論52-54
• 5 結(jié)論54-55
• 全文結(jié)論55-56
• 參考文獻(xiàn)56-68
• 英文縮略詞索引68-70
• 在讀期間發(fā)表的論文70-71
• 致謝71-72

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 汪杰;;手術(shù)切除局限性神經(jīng)性皮炎20例[J];四川醫(yī)學(xué);1993年05期

2 熊德鑫，祝小楓，盛志勇;痤瘡皮損區(qū)皮膚菌群的研究[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;1994年05期

3 胡孝銘，胡海軍;皮損區(qū)十字法針刺治療帶狀皰疹156例[J];實(shí)用鄉(xiāng)村醫(yī)生雜志;1995年01期

4 李靈,王尚蘭;皮損區(qū)磨削、吸皰法表皮移植治療白癜風(fēng)療效比較[J];醫(yī)學(xué)科技;2000年01期

5 熊德鑫，祝小楓，盛志勇;黃褐斑病人皮損區(qū)皮膚菌群的研究[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;1994年06期

6 普雄明,石得仁;銀屑病皮損及非皮損區(qū)血管的免疫組化觀察[J];中華皮膚科雜志;1995年02期

7 萬苗堅(jiān),趙廣,蔡瑞康,張其亮,文海泉;黃褐斑患者皮損區(qū)微生態(tài)改變的探討[J];臨床皮膚科雜志;1997年02期

8 黨倩麗 ,呂俊霞,李長海;氧自由基在銀屑病皮損區(qū)作用的研究[J];陜西醫(yī)學(xué)雜志;2002年09期

9 白潔;隋靜;王真子;白穎;;健康人和黃褐斑患者皮損區(qū)菌群的探討[J];中國微生態(tài)學(xué)雜志;2006年02期

10 李靈;皮損區(qū)磨削加吸皰法表皮移植治療白癜風(fēng)療效觀察[J];四川醫(yī)學(xué);2001年07期

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 許愛娥;吳辛剛;;進(jìn)行性斑狀色素減少癥的臨床及實(shí)驗(yàn)研究[A];2009全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

2 許愛娥;吳辛剛;;進(jìn)行性斑狀色素減少癥的臨床及實(shí)驗(yàn)研究[A];2009年浙江省皮膚病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2009年

3 陸毅;馮信忠;CorrineLebreton;BernardCoulomb;LouisDubertret;;細(xì)胞因子在銀屑病非皮損區(qū)成纖維細(xì)胞中的表達(dá)(英文)[A];2002中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2002年

4 頡玉勝;范文成;馬愛紅;孟全林;;先天性局部毛增多癥1例[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第14次全國皮膚性病學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2008年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 劉玉英;緩激肽B1受體在慢性炎性皮損區(qū)癢感覺中的作用[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

2 封居冕;緩激肽受體在炎性皮損區(qū)異常癢感覺中作用的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2014年

，

本文編號(hào)：897347