本文關(guān)鍵詞：二甲雙胍通過mTOR信號(hào)通路對(duì)Hacat角質(zhì)形成細(xì)胞增殖的影響

  更多相關(guān)文章： 二甲雙胍 Hacat細(xì)胞 mTOR信號(hào)通路

【摘要】：從20世紀(jì)50年代至今,二甲雙胍已成為臨床上治療2型糖尿病的一線口服降糖藥,它可以通過多種作用途徑發(fā)揮降低血糖、改善胰島素抵抗和代謝綜合征的作用。2005年,英國科學(xué)家Evans發(fā)表的一項(xiàng)研究結(jié)果顯示,二甲雙胍能顯著降低糖尿病患者的腫瘤風(fēng)險(xiǎn)和腫瘤患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。這篇文章發(fā)表以后,引起科學(xué)家的廣泛興趣,二甲雙胍藥理機(jī)制研究成為新的熱點(diǎn),臨床適應(yīng)癥也隨之不斷擴(kuò)大。近年來大量研究表明,二甲雙胍與乳腺癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌、白血病等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及預(yù)后等密切相關(guān),在多種惡性增生性疾病中,二甲雙胍可以通過抑制細(xì)胞的生長增殖和免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),減少腫瘤細(xì)胞侵襲性,降低腫瘤患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。在皮膚科領(lǐng)域,已有報(bào)道二甲雙胍在部分多毛癥、痤瘡、化膿性汗腺炎、銀屑病、皮膚腫瘤等方面發(fā)揮有益作用。二甲雙胍能抑制黑素瘤細(xì)胞、皮膚鱗癌細(xì)胞的增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡,使動(dòng)物移植腫瘤變小。另外,在對(duì)2008年一項(xiàng)36702例患者的大樣本病例對(duì)照研究和2015年臺(tái)灣的一項(xiàng)包括1659727患者的研究顯示,二甲雙胍除了對(duì)銀屑病患者潛在的有益治療作用以外,長期接受二甲雙胍治療的糖尿病患者的銀屑病患病危險(xiǎn)率顯著下降。二甲雙胍的生物學(xué)作用機(jī)制主要是通過組織細(xì)胞中最重要的能量代謝調(diào)節(jié)通路AMPK (Adenosine 5'-monophosphate (AMP)-activated protein kinase)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)。二甲雙胍激活A(yù)MPK后,通過抑制下游的信號(hào)關(guān)鍵性分子mTOR (mammalian target of rapamycin)協(xié)同相關(guān)因子來調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及蛋白質(zhì)合成,最終影響細(xì)胞的增殖。mTOR信號(hào)通路被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化的關(guān)鍵信號(hào)通路,它主要通過促進(jìn)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的關(guān)鍵代謝過程,對(duì)營養(yǎng)水平、能量、各種生長因子以及環(huán)境因素等產(chǎn)生應(yīng)答,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的不同生理活動(dòng),影響細(xì)胞的生長、增殖及凋亡,從而在多種腫瘤的發(fā)病、進(jìn)展及預(yù)后中發(fā)揮重要作用。值得強(qiáng)調(diào)的是,在AMPK信號(hào)沒有激活的情況下,二甲雙胍也可以直接或通過其它多種途徑抑制mTOR信號(hào)通路從而發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。mTOR信號(hào)通路異常也參與多種皮膚疾病的發(fā)生發(fā)展,包括黑色素瘤,皮膚鱗狀細(xì)胞癌等惡性皮膚腫瘤及痤瘡、銀屑病等良性炎癥性皮膚疾病。研究顯示在尋常型銀屑病皮損中mTOR在表皮全層高表達(dá),特別在基底層表達(dá)明顯增高；mTOR信號(hào)通路下游的一個(gè)關(guān)鍵性因子-核糖體蛋白S6(SK6)在基底層以上的角質(zhì)細(xì)胞中也呈激活狀態(tài)。此外,mTOR信號(hào)通路可能通過介導(dǎo)表皮增生、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)、血管生成等在銀屑病的病理生理中發(fā)揮作用。目前已有多種靶向抑制mmTOR信號(hào)通路的藥物在研發(fā)及臨床試驗(yàn)階段,已經(jīng)展示出良好的抗腫瘤效果。然而,二甲雙胍與mTOR信號(hào)通路對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞良性增殖的影響目前尚無相關(guān)基礎(chǔ)研究。本課題通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn),檢測二甲雙胍對(duì)Hacat角質(zhì)形成細(xì)胞增殖、凋亡的作用及其對(duì)Hacat細(xì)胞分泌促炎癥因子的影響,并通過分子生物學(xué)的方法對(duì)其涉及的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)行初步研究,從而探討二甲雙胍作為一種抗角質(zhì)形成細(xì)胞增殖藥物應(yīng)用于臨床治療銀屑病的可行性。第一部分二甲雙胍對(duì)Hacat細(xì)胞體外增殖和凋亡的影響目的：觀察二甲雙胍干預(yù)后實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,并運(yùn)用MTT(甲基噻唑基四唑)和流式細(xì)胞檢測方法,探討二甲雙胍對(duì)Hacat細(xì)胞生長、增殖及凋亡的影響。方法：實(shí)驗(yàn)分為實(shí)驗(yàn)組、空白對(duì)照組(不加任何藥物)。Hacat細(xì)胞分別以1x104/孔的密度在接種在96孔板中,37℃在5%CO2孵箱中培養(yǎng)過夜。(1)以25、50、100mmol/L三種濃度的二甲雙胍分別對(duì)體外培養(yǎng)的Hacat細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),在干預(yù)后第0、24、48、72和96h,MTT法檢測各組細(xì)胞的增殖情況。(2)以25、50、100mmol/L不同濃度二甲雙胍作用于Hacat細(xì)胞48h后,用不含EDTA的0.25%胰酶消化Hacat細(xì)胞并收集于流式管,Annexin V-FITC標(biāo)記,應(yīng)用流式細(xì)胞檢測各組細(xì)胞的凋亡狀況。結(jié)果：(1)貼壁生長的Hacat細(xì)胞中加入不同濃度的二甲雙胍,在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)隨著藥物濃度增加和作用時(shí)間的延長,細(xì)胞的形態(tài)學(xué)發(fā)生明顯的變化,細(xì)胞變圓變小,核固縮、碎裂,脫落漂浮細(xì)胞增多,細(xì)胞凋亡增加。(2)根據(jù)MTT測定的A490值而繪制細(xì)胞生長曲線,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,隨著作用濃度及作用時(shí)間的延長,二甲雙胍能有效抑制Hacat田胞的生長,其中以50mmol/L以上濃度時(shí)抑制作用更為明顯。以藥物作用時(shí)間為橫軸,細(xì)胞OD490值為縱軸,繪制細(xì)胞生長曲線,可以發(fā)現(xiàn)隨著二甲雙胍作用于Hacat細(xì)胞時(shí)間的延長,細(xì)胞的生長能力有明顯下降。與對(duì)照組相比,不同濃度二甲雙胍均能抑制Hacat細(xì)胞生長,25mmol/L二甲雙胍作用48h后細(xì)胞呈明顯生長抑制(P0.05),50mmol/L組和100mmol/L二甲雙胍干預(yù)細(xì)胞24h后,細(xì)胞的增殖活性即顯著下降(P0.05),100mmol/L組下降更為明顯(P0.01)；計(jì)算細(xì)胞的存活率,結(jié)果顯示隨著作用時(shí)間的延長,存活細(xì)胞逐漸減少,50mmol/L的二甲雙胍作用于細(xì)胞24、48、72和961時(shí),細(xì)胞的存活率分別為75.6%、59.4%、40.7%和30.3%。(3)不同濃度二甲雙胍作用于Hacat細(xì)胞48h后,與對(duì)照組相比,各組的細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均有所增加,其中50mmol/L組細(xì)胞的凋亡率比對(duì)照組增加(P0.05),早期凋亡細(xì)胞多于晚期凋亡細(xì)胞。100mmol/L組細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡率均顯著增高(均P0.01),大部分細(xì)胞凋亡,晚期凋亡率更加明顯。結(jié)論：二甲雙胍能有效抑制體外培養(yǎng)Hacat細(xì)胞的生長、增殖,并誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡和晚期凋亡,這種細(xì)胞生長抑制作用呈濃度及時(shí)間依賴性增強(qiáng)。第二部分二甲雙胍對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌促炎癥因子的影響目的：應(yīng)用ELISA方法檢測不同濃度二甲雙胍對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌促炎癥因子IL-6, TNF-α和VEGF表達(dá)水平的影響,以探討二甲雙胍對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。方法：對(duì)數(shù)生長期的Hacat細(xì)胞以2×105/孔密度接種于6孔板中培養(yǎng)過夜,細(xì)胞貼壁后用不含血清的DMEM同步化24h,以25、50、100mmol/L濃度的二甲雙胍分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)48h,提取細(xì)胞上清液,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測細(xì)胞上清液中促炎癥因子IL-6, TNF-α和VEGF蛋白表達(dá)水平,450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。結(jié)果：不同濃度的二甲雙胍作用于Hacat細(xì)胞48h均能抑制細(xì)胞分泌IL-6,TNF-α和VEGF的表達(dá)水平,隨著二甲雙胍濃度的增加抑制作用更加明顯。25mmol/L濃度的二甲雙胍即對(duì)IL-6有明顯抑制作用(P0.05),50mmol/L和100mmol/L的二甲雙胍對(duì)IL-6抑制作用更加顯著(P0.01),50mmol/L的二甲雙胍TNF-α和VEGF蛋白均有明顯抑制作用(P0.05),100mmol/L的二甲雙胍對(duì)VEGF有顯著抑制作用(P0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明二甲雙胍能抑制Hacat細(xì)胞分泌的多種促炎癥因子,推測二甲雙胍能減輕角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥反應(yīng),從而減輕炎癥浸潤和血管形成對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞的促增殖作用。結(jié)論：本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示二甲雙胍能抑制Hacat細(xì)胞分泌IL-6, TNF-α和VEGF的表達(dá)水平,并呈一定的濃度依賴性,進(jìn)一步驗(yàn)證了二甲雙胍的免疫調(diào)節(jié)作用。第三部分mTOR信號(hào)通路在二甲雙胍抑制HacaT細(xì)胞增殖中的作用目的：研究二甲雙胍對(duì)Hacat細(xì)胞內(nèi)mTOR信號(hào)通路中關(guān)鍵分子mTOR和p70S6K的磷酸化蛋白及總蛋白表達(dá)水平的影響,探討mTOR信號(hào)通路在二甲雙胍對(duì)Hacat細(xì)胞生長抑制中的作用。方法：對(duì)數(shù)生長期的Hacat細(xì)胞接種在60mm培養(yǎng)瓶中,37℃在5%C02孵箱中培養(yǎng)過夜,細(xì)胞貼壁后用不含血清的DMEM同步化24h,以25、50、100mmol/L濃度的二甲雙胍作用于細(xì)胞48h,分別抽提細(xì)胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳和轉(zhuǎn)膜,考馬斯亮藍(lán)染色后,用TBST液(含5%脫脂奶粉)封閉非特異抗原,加入mTOR、p-mTOR (ser2448)、p70S6K、p-p70S6K一抗4℃孵育過夜,TBST洗滌3次后加入含辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗反應(yīng)1h,顯色后化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)采集圖像。實(shí)驗(yàn)以β-actin作為內(nèi)參照。結(jié)果：(1)不同濃度二甲雙胍干預(yù)前后,Hacat細(xì)胞內(nèi)mTOR和p70S6K的總蛋白表達(dá)強(qiáng)度無顯著變化。但是二甲雙胍能明顯抑制細(xì)胞內(nèi)p-mTOR和p-p70S6K蛋白水平,濃度為25、50、100mmol/L的二甲雙胍作用于Hacat細(xì)胞48h, p-mTOR分別下降23.7%、49.0%和80.6%；p-p70S6K/分別下降30.2%、62.1%和81.2%,結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：二甲雙胍能抑制Hacat細(xì)胞中mTOR和p70S6K蛋白的磷酸化,mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與了二甲雙胍對(duì)Hacat細(xì)胞增殖、凋亡和分泌促炎癥因子的調(diào)控。
【關(guān)鍵詞】：二甲雙胍 Hacat細(xì)胞 mTOR信號(hào)通路
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R758.63
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-14
• 符號(hào)說明14-15
• 文獻(xiàn)綜述15-33
• 參考女獻(xiàn)24-33
• 第一部分 二甲雙胍對(duì)Hacat細(xì)胞體外增殖和凋亡的影響33-43
• 材料與方法33-36
• 結(jié)果36-37
• 討論37-39
• 結(jié)論39
• 附圖39-41
• 參考文獻(xiàn)41-43
• 第二部分：二甲雙胍對(duì)HaCaT細(xì)胞分泌炎癥因子的影響43-52
• 材料與方法43-45
• 結(jié)果45
• 討論45-48
• 結(jié)論48
• 附圖48-49
• 參考文獻(xiàn)49-52
• 第三部分 mTOR信號(hào)通路在二甲雙胍抑制HaCaT細(xì)胞增殖中的作用52-62
• 材料與方法52-57
• 結(jié)果57-58
• 討論58-60
• 結(jié)論60
• 附圖60-61
• 參考文獻(xiàn)61-62
• 小結(jié)62-63
• 致謝63-64
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文64-65
• 附件65-66
• English Paper66-83

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 王穎超;劉滿菊;朱桂英;王軍博;蔣蘭君;;Th17/Treg細(xì)胞比例失衡在兒童原發(fā)性免疫性血小板減少癥中的意義[J];中國當(dāng)代兒科雜志;2016年03期

2 Elisabeth Uitz;Babak Bahadori;Mark F McCarty;Mohammed H Moghadasian;;Practical strategies for modulating foam cell formation and behavior[J];World Journal of Clinical Cases;2014年10期

3 李薇;張錫寶;陳曉吟;劉玉梅;;311例銀屑病患者合并代謝綜合征調(diào)查分析[J];中國麻風(fēng)皮膚病雜志;2014年06期

4 李文飛;張福仁;;銀屑病與代謝綜合征相關(guān)性研究進(jìn)展[J];中國麻風(fēng)皮膚病雜志;2014年07期

5 吉蘇云;臧志軍;馬寒;周春;羅玉燕;谷梅;;代謝綜合征、抑郁及性激素水平對(duì)銀屑病患者勃起功能障礙的影響[J];皮膚性病診療學(xué)雜志;2015年03期

6 吉蘇云;臧志軍;馬寒;袁立燕;戚世玲;王宇;白順;谷梅;楊斌;;Wnt5a、Sfrp5水平與尋常型銀屑病及肥胖的相關(guān)性分析[J];皮膚性病診療學(xué)雜志;2015年04期

7 周欣;畢新嶺;顧軍;;維生素D在銀屑病和代謝綜合征中的作用[J];中國麻風(fēng)皮膚病雜志;2015年06期

8 Maria Dalamaga;Evangelia Papadavid;;Metabolic co-morbidities and psoriasis: The chicken or the egg?[J];World Journal of Dermatology;2013年04期

9 柯丹;萬遠(yuǎn)芳;刁慶春;;銀屑病患者并發(fā)代謝性疾病的相關(guān)性分析[J];中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)雜志;2014年05期

10 韓姍姍;李輝;黨翔吉;牛倩倩;陳夢(mèng)鈺;焦海勝;;銀屑片治療小鼠銀屑病的實(shí)驗(yàn)研究[J];中成藥;2014年12期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前7條

1 薛茹月;基底硬度及細(xì)胞密度對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞骨分化的影響及機(jī)理研究[D];重慶大學(xué);2013年

2 王遠(yuǎn)孝;IUGR豬的生長與腸道發(fā)育及L-精氨酸和大豆卵磷脂的營養(yǎng)調(diào)控研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

3 汪長發(fā);茉莉酸甲酯對(duì)肝癌的抑制作用及其機(jī)理研究[D];中南大學(xué);2013年

4 龔睿;Rag GTPases蛋白復(fù)合物介導(dǎo)氨基酸激活mTORC1的分子機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

5 李文飛;銀屑病合并代謝綜合征及相關(guān)因素的前瞻性研究[D];山東大學(xué);2014年

6 景t，

本文編號(hào)：892509