本文關鍵詞：上皮—間充質轉化在銀屑病中的研究

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【摘要】：研究背景上皮-間充質轉化(EMT)是一種胚胎時期出現(xiàn)過的一個基本過程,同時也是傷口愈合、器官纖維化以及惡性上皮腫瘤發(fā)生的基礎。研究EMT對于認識和理解炎癥性疾病發(fā)生、發(fā)展的病理生理機制都有十分重要的意義。銀屑病是以表皮過度增殖、血管內皮異常增生和淋巴細胞浸潤為特征的慢性炎癥性皮膚病。表皮角質形成細胞在增殖和遷移中表型轉變,其抗凋亡、遷移能力顯著提升,這個過程類似于上皮-間充質轉化的過程,為了進一步證實猜想,我們開展了這個課題的研究。目的明確EMT相關分子標志物在皮膚角質形成細胞及皮膚組織中的定位；明確EMT相關分子標志物在正常皮膚組織及體外培養(yǎng)角質形成細胞中的表達量；闡明EMT相關分子標志物在銀屑病中表達的相關調控因素；EMT相關分子標志物在銀屑病發(fā)生發(fā)展中的作用機制。方法獲取來自銀屑病病人皮膚樣本,并進行角質形成細胞原代培養(yǎng)。免疫熒光及免疫組化法研究EMT相關分子標志物在銀屑病皮膚組織及細胞的定位。提取組織及細胞的RNA和蛋白質,進行定量PCR、免疫印跡實驗,分析EMT相關分子標志物的表達量。經銀屑病相關細胞因子處理,進一步觀察EMT相關分子標志物不同細胞因子處理下在銀屑病角質形成細胞中的表達差異。經ERK、Rho和GSK3的抑制劑分別處理以及與地塞米松聯(lián)合處理,以此觀察EMT相關分子標志物在銀屑病發(fā)生發(fā)展中的作用機制。結果正常皮膚及銀屑病皮膚樣本中上皮間質轉化分子標志物的表達1.上皮細胞分子標記物E-cad和β-catenin在正常表皮和銀屑病表皮全層中均有表達；K10和K16定位于表皮層棘層以上,正常和銀屑病表皮中定位無明顯差異。K14在正常表皮中定位于基底及基底上層,而在銀屑病表皮中則定位于表皮全層。2.在正常和銀屑病真皮中均沒有上皮分子標志物E-cad,K10,K14和K16的表達。3.在正常表皮中沒有間質分子標志物Vim, Snail, Slug, FN和N-cad的表達。4.在銀屑病表皮中,間質細胞分子標志物Vim, Snail, Slug和FN大量表達,N-cad中等量表達。1.體外培養(yǎng)正常和銀屑病角質形成細胞中上皮間質轉化分子標志物RNA和蛋白水平1.與正常角質形成細胞相比,銀屑病角質形成細胞中上皮間質轉化分子標志物轉錄組測序水平為K10下調,Vim,FN,PAI-1和Snail RNA水平上調,E-cad,K14, K16,N-cad,β-catenin和Slug沒有明顯差異。2.正常和銀屑病角質形成細胞中,Vim, FN和PAI-1 mRNA水平有顯著差異(P0.01),而E-cad,K10,K14,K16,N-cad,β-catenin,Snail和Slug mRNA水平無統(tǒng)計學差異。3.正常和銀屑病角質形成細胞中,Vim,FN和PAI-1蛋白水平有顯著差異。2.銀屑病角質形成細胞中上皮間質轉化分子標志物的調控機制1.上皮分子標志物E-cad在TNF-a作用下表達略微升高,K10在IL-8,TGF-β1,IL-13,尤其是IL-17A和TNF-α的作用下表達顯著下調。K14在IL-17A的作用下表達降低而TGF-β1對其作用相反,TGF-β1也使N-cad表達顯著上調。2.IL-17A和IL-13下調間質分子標志物Vim和FN mRNA水平,而TGF-β1則作用相反。3.TNF-α上調FN而下調Slug的表達,TGF-β1上調PAI-1,Snail在IL-17A作用下表達上調,而IL-8則促其下調。4.MAPK/ERK、Rho/ROCK和Wnt/GSK3信號通路在銀屑病角質形成細胞EMT的作用1.Y27632阻斷Rho,或SB216763阻斷GSK3后均能引起E-cad,β-catenin和Slug RNA和蛋白水平的升高。2.單獨使用地塞米松在0.2gM濃度時可使Slug下調而對E-cad和P-catenin無影響,在2μM濃度時引起E-cad表達升高和Slug的表達降低。3.地塞米松在0.2μM的濃度與Y27632共孵育時能明顯抑制Y27632所引起的E-cad,β-catenin和Slug表達上調,但在其2μM濃度時只影響Y27632對β-catenin的影響。4.SB216763介導的E-cad過表達在地塞米松0.2μM和2μM濃度時均被抑制,而對β-catenin和Slug的影響則只有在地塞米松2gM濃度時則被抑制。結論1.表皮角質形成細胞的特征是上調間充質分子標志物Vim,FN和PAI-1,而上皮分子標志物E-cad,K10和K14并無明顯變化。2.在銀屑病EMT中,IL-17A和LI-13是負性調節(jié)因子,TGF-β1則是正性調節(jié)因子,TNF-a的作用多向性。3.ERK,Rho和GSK3信號通道參與銀屑病角質形成細胞EMT過程,而地塞米松起保護作用。4.銀屑病屬于EMT的2型中間表型。
【關鍵詞】：上皮間質轉化 銀屑病 E-cadherin Vimentin 角質形成細胞
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R758.63
【目錄】：

• 致謝4-6
• 中文摘要6-10
• 英文摘要10-14
• 本課題中使用到的主要儀器14-15
• 主要試劑的配制15-18
• 英文縮寫注釋18-22
• 1 前言22-25
• 2 材料與方法25-33
• 2.1 實驗材料25
• 2.2 標本收集25-26
• 2.3 表皮角質形成細胞(KC)原代培養(yǎng)26
• 2.4 RNA提取,逆轉錄及實時熒光定量PCR26-27
• 2.5 免疫熒光法27-28
• 2.6 免疫組化法28
• 2.7 免疫印跡(western blot)28-32
• 2.8 統(tǒng)計學分析32-33
• 3 結果33-46
• 3.1 正常皮膚及銀屑病皮膚樣本中上皮間質轉化分子標志物的表達33-36
• 3.2 體外培養(yǎng)正常和銀屑病角質形成細胞中上皮間質轉化分子標志物RNA和蛋白水平36-38
• 3.3 銀屑病角質形成細胞中上皮間質轉化分子標志物的調控機制38-41
• 3.4 MAPK/ERK、Rho/ROCK和Wnt/GSK3信號通路在銀屑病角質形成細胞EMT的作用41-46
• 4. 討論46-49
• 5 結論49-50
• 參考文獻50-58
• 綜述58-68
• 參考文獻63-68
• 個人簡歷68

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本文編號：882756