本文關鍵詞：二甲雙胍對HaCaT細胞增殖信號通路及豚鼠耳銀屑病模型影響研究

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【摘要】：第一部分二甲雙胍對HaCaT細胞增殖信號通路影響研究目的：二甲雙胍作為一種胰島素增敏劑,被廣泛應用于Ⅱ型糖尿病的治療。最近的研究證明,二甲雙胍能顯著抑制多種腫瘤細胞的生長,包括乳腺癌、卵巢癌、子宮內膜癌、胰腺癌等惡性腫瘤,二甲雙胍具有抑制腫瘤細胞增殖的功效。銀屑病中存在明顯的角質形成細胞增殖和分化的異常,HaCaT細胞具有銀屑病皮損處角質形成細胞所表現(xiàn)的過度增殖的特征,該細胞被廣泛的用于體外抗銀屑病藥物的研究模型。本研究從細胞增殖調控角度出發(fā),利用HaCaT細胞研究二甲雙胍對細胞增殖以及細胞增殖調控相關蛋白表達的影響,探討二甲雙胍治療銀屑病的可能分子機制,為二甲雙胍治療銀屑病提供理論基礎。 方法：1.培養(yǎng)HaCaT細胞觀察二甲雙胍對其形態(tài)學影響以0、25、50和75mmol/L四種濃度的二甲雙胍對HaCaT細胞進行干預,24h后在倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)的變化；2.CCK-8比色法檢測二甲雙胍對HaCaT細胞增殖的影響采用50mmol/L的二甲雙胍干預對數(shù)生長期的HaCaT細胞,分別于24h、48h和72h收集細胞,利用CCK-8比色法檢測細胞的增殖活性；3.Western blot法檢測二甲雙胍對HaCaT細胞內AMPK、ERK1/2蛋白表達的影響50mmol/L的二甲雙胍干預HaCaT細胞,24h后提取細胞總蛋白并對蛋白定量,以Western blot法檢測細胞內AMPK、ERK1/2蛋白的磷酸化水平。4.統(tǒng)計學分析結果采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析。所有實驗數(shù)據(jù)結果均取均數(shù)±標準差,以(x±s)表示,多組均數(shù)比較用單因素方差分析,兩組均數(shù)比較用t檢驗,P0.05表明差異有顯著的統(tǒng)計學 意義。 結果：1.二甲雙胍對HaCaT細胞形態(tài)學的影響HaCaT細胞經(jīng)過二甲雙胍干預24h以后,Ommol/L組和25mmol/L組在細胞形狀和大小上無顯著變化,僅表現(xiàn)為粘附性降低,部分細胞脫落、漂浮；50mmol/L組細胞體積稍變小,細胞內顆粒、空泡增多,細胞粘附性變差,有較多細胞從瓶壁脫落,漂浮于培養(yǎng)液中；75mmol/L組細胞全部脫落、漂浮。2.二甲雙胍對HaCaT細胞增殖的影響50mmol/L二甲雙胍干預后HaCaT細胞的存活率第24h為36.18%、48h為12.70%、72h為10.12%,隨著二甲雙胍作用時間延長,HaCaT細胞的存活率逐漸下降。3.二甲雙胍對HaCaT細胞內AMPK、ERK1/2蛋白表達的影響二甲雙胍干預前,HaCaT細胞內檢測到的p-AMPK與β-actin的平均吸光度值比值為2.856±0.323,50mmol/L二甲雙胍干預后為5.198±0.625,二者比較有顯著統(tǒng)計學意義(t=55.376,p=0.00,p0.05)；二甲雙胍干預前,HaCaT細胞內p-ERKl/2與β-actin的平均吸光度值比值為7.550±1.087,50mmol/L二甲雙胍干預后為10.430±1.217,二者比較有顯著統(tǒng)計學意義(t=12.461,p=0.012,p0.05),提示二甲雙胍干預可導致p-AMPK,p-ERK1／2表達上調。 結論：二甲雙胍可以顯著抑制HaCaT細胞的增殖活性,其抑制率與時間呈正相關,提示二甲雙胍可通過激活AMPK,作用于ERK1/2信號傳導通路,并作用于下游的靶基因,進而抑制HaCaT細胞的增殖。 第二部分二甲雙胍對豚鼠耳銀屑病模型影響的研究 目的：豚鼠耳部銀屑病模型能夠較好的模擬銀屑病皮損部位的典型組織病理改變,本研究通過構建豚鼠耳部銀屑病模型,研究二甲雙胍對豚鼠耳部銀屑病樣模型病理改變的影響,探討二甲雙胍在臨床治療銀屑病的可行性,并初步探討其作用機制,為二甲雙胍治療銀屑病研究提供初步的數(shù)據(jù)和資料。 方法：3-4周齡Hartley豚鼠50只,隨機選取10只為正常對照組,其余40只構建豚鼠耳部的銀屑病樣病理改變模型,以5%普萘洛爾軟膏均勻涂于豚鼠耳背,每日3次,厚度1.Omm,連續(xù)4周,造成豚鼠耳部的銀屑病樣動物模型,設非干預組、生理鹽水對照組及50mmol/L二甲雙胍組、100mmol/L的二甲雙胍組。4周后,分別用生理鹽水、50mmol/L二甲雙胍、100mmol/L二甲雙胍外涂豚鼠耳部造模處,每日三次,連用4周。4周后取豚鼠耳部標本制作組織病理切片。采用Baker法對各組切片組織學積分進行評估并檢測二甲雙胍干預前后豚鼠耳部表皮的厚度。應用SPSS13.0統(tǒng)計軟件對結果進行統(tǒng)計學分析。 結果：1.肉眼觀察基本情況正常對照組豚鼠精神好,習性溫順,膽小易驚,毛發(fā)濃密有光澤,緊貼皮膚,飲食、二便正常。所有造模動物2周后出現(xiàn)搔抓耳部現(xiàn)象,耳背部涂藥處毛發(fā)部分脫落,部分動物耳背局部皮膚紅,毛細血管擴張明顯。4周后造模動物上述癥狀加重并出現(xiàn)搔抓耳部現(xiàn)象。二甲雙胍組治療4周后,豚鼠上述癥狀明顯減輕。2.光鏡下觀察豚鼠耳背部表皮厚度值測量和Baker法對組織評分造模組鏡下可見廣泛角化過度及灶性角化不全,部分角化不全部位可見Munro微膿腫；顆粒層變薄或消失；棘層明顯肥厚,表皮突下延,真皮乳頭上抬；毛細血管擴張、充血,真皮淺層及乳頭部可見單一核及多形核細胞浸潤,提示造模成功。50mmol/L二甲雙胍組、100mmol/L二甲雙胍組鏡下均可見角化過度及角化不全現(xiàn)象減輕,棘層變薄,皮突不明顯,毛細血管擴張和炎癥細胞浸潤現(xiàn)象改善,未見Munro微膿腫。Baker評分分別為1.25±0.43,1.43±0.25,耳背部表皮厚度值分別為64.98±7.01,61.08±6.09。50mmol/L、100mmol/L二甲雙胍組與生理鹽水組Baker評分及耳背部表皮厚度值比較均存在顯著差異。50mmol/L二甲雙胍組、100mmol/L二甲雙胍組之間Baker評分及耳背部表皮厚度值比較無顯著差異。實驗顯示,二甲雙胍治療組Baker評分和豚鼠耳部表皮的厚度均出現(xiàn)不同程度下降,與造模后觀察組比較有顯著的統(tǒng)計學意義,表明二甲雙胍可改善豚鼠耳部銀屑病樣模型的病理變化。 結論：二甲雙胍可改善豚鼠耳部銀屑病樣模型的病理變化。其作用機理可能與抑制細胞的過度增殖,抑制炎癥因子的釋放,減輕局部的炎癥反應,減輕局部的血管擴張有關。
【關鍵詞】：二甲雙胍 HaCaT細胞 增殖 AMPK ERK1/2 二甲雙胍 尋常型銀屑病 動物模型 作用機理
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R758.63;R-332
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-14
• 符號說明14-15
• 第一部分15-42
• 前言15-16
• 材料和方法16-25
• 結果25-27
• 討論27-32
• 結論32-33
• 附圖33-37
• 參考文獻37-42
• 第二部分42-66
• 前言42-43
• 材料和方法43-47
• 結果47-49
• 討論49-55
• 結論55-56
• 附圖56-60
• 參考文獻60-66
• 創(chuàng)新性和局限性66-67
• 致謝67-68
• 攻讀博士期間的學術成果68-69
• APPENDING PAPER69-103
• APPENDING PAPER l69-79
• APPENDING PAPER 279-103
• 學位論文評閱及答辯情況表103

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