本文關(guān)鍵詞：全基因組外顯子測序搜尋一維吾爾族表皮松解性掌跖角化癥大家系致病基因及其作用機制研究

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【摘要】：目的:表皮松解性掌跖角化癥(epidermolytic palmoplantar keratoderma,EPPK,OMIM:144200)是一種常染色體顯性遺傳性皮膚病,以掌跖部的角化性斑塊為主要臨床特點。EPPK具有遺傳異質(zhì)性,已有不同民族及種族中EPPK致病基因的相關(guān)報道。目前仍未見有維吾爾族人群關(guān)于EPPK致病基因及發(fā)病機制的相關(guān)報道。本研究收集一維吾爾族表皮松解性掌跖角化癥大家系臨床癥狀,繪制其家系圖,分析維吾爾族EPPK遺傳特征。通過全基因組外顯子測序結(jié)合前期連鎖分析發(fā)現(xiàn)EPPK的候選致病基因。通過對候選致病基因進行驗證,明確維吾爾族EPPK的致病基因。為了更好的了解致病基因在EPPK中的發(fā)病機制,本研究利用免疫組化的方法進一步探查由于致病基因突變,可能導(dǎo)致表皮內(nèi)的角蛋白表達異常,為EPPK的發(fā)病機制研究提供一定的理論基礎(chǔ)。EPPK目前無特異性治療方法,RNA干擾技術(shù)已應(yīng)用與相關(guān)單基因疾病的研究,本研究通過siRNA轉(zhuǎn)染入角質(zhì)形成細胞中,特異性抑制致病基因的表達。本研究初步闡明了EPPK的發(fā)病機制,為EPPK的早期診斷、RNA干擾技術(shù)的靶向治療提供一定的理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。方法:(1)對家系中的兩名患者(IV56和III31)進行全基因組外顯子測序,結(jié)合前期連鎖分析結(jié)果篩選候選基因。(2)利用軟件預(yù)測突變對蛋白功能的影響進一步篩選,減少候選基因數(shù)量。(3)通過PCR測序方法,家系內(nèi)及健康對照驗證,同時收集一維吾爾族EPPK小家系進一步驗證。(4)化學(xué)合成致病基因特異的siRNA序列與質(zhì)粒,利用陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染共到HaCaT細胞中。(5)采用RT PCR和Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染前后HaCaT細胞中KRT9 mRNA和蛋白水平的變化情況。(6)RT PCR檢測siRNA轉(zhuǎn)染前后KRT1、KRT5、KRT6、KRT16、KRT10、KRT14及KRT12的mRNA水平的變化。(7)共聚焦顯微鏡檢測siRNA轉(zhuǎn)染前后細胞骨架結(jié)構(gòu)變化。(8)免疫組化法檢測EPPK患者與健康對照中其它相關(guān)角蛋白的表達量及表達位置是否具有差異性。結(jié)果:(1)經(jīng)過全基因組外顯子測序后,結(jié)合前期連鎖分析結(jié)果,家系內(nèi)外驗證,維吾爾族EPPK致病基因為KRT9 c.C487T(p.R163W)。(2)針對HaCaT細胞轉(zhuǎn)染入KRT9 c.C487T(p.R163W)質(zhì)粒,使其突變的K9過表達,針對突變位點設(shè)計siRNA,轉(zhuǎn)染入過表達細胞中,RT-PCR及weston bolt結(jié)果顯示K9-R163W組及k9-R163W+siRNA-R163W組,KRT9 mRNA的相對表達量分別是1.063±0.159,0.242±0.051,蛋白的相對表達量分別是1.1329±0.131,0.289±0.036。針對突變位點設(shè)計的siRNA能顯著抑制KRT9 R163W的相對表達量(P0.05)。(3)KRT9 c.C487T(p.R163W)高表達時,KRT6、KRT16及KRT10 mRNA水平表達較KRT9 c.C487T(p.R163W)低表達時具有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。(4)KRT9 c.C487T(p.R163W)高表達時,角質(zhì)形成細胞的骨架結(jié)構(gòu)呈雜亂無序狀態(tài),部分細胞骨架結(jié)構(gòu)消失。(4)免疫組化蛋白表達分析結(jié)果顯示,EPPK皮損較正常健康對照表皮中出現(xiàn)K5,K2蛋白表達量的下調(diào),K10,K6和K16蛋白表達量的上調(diào);Ki-67和p63蛋白表達量和分布發(fā)生改變。結(jié)論:(1)KRT9 c.C487T(p.R163W)為導(dǎo)致此維吾爾族表皮松解性掌跖角化癥發(fā)病的致病突變,其的遺傳學(xué)發(fā)病機制提供了理論基礎(chǔ)。(2)應(yīng)用RNA干擾特異性干擾突變型KRT9 c.C487T(p.R163W)基因及野生型KRT9的表達,證明致病基因高表達時引起病損組織角蛋白的平衡破壞,影響細胞的骨架結(jié)構(gòu),低表達時則細胞結(jié)構(gòu)不受破壞,為表皮松解性掌跖角化癥的發(fā)病機制研究及基因治療提供新的思路。(3)針對KRT9 c.C487T(p.R163W)突變位點siRNA能特異性抑制突變KRT9基因的表達,為EPPK的靶向治療提供理論依據(jù)。(4)KRT9 c.C487T(p.R163W)的基因突變,可能導(dǎo)致病損組織細胞角蛋白的平衡遭到破壞,病損組織基底細胞存在過度增殖的現(xiàn)象,是導(dǎo)致EPPK的發(fā)病基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：表皮松解性掌跖角化癥 全基因組外顯子測序 siRNA
【學(xué)位授予單位】：新疆醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R758.5
【目錄】：

• 中英文縮略詞對照表5-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-17
• 第一部分：全基因組外顯子測序發(fā)現(xiàn)一維吾爾族EPPK大家系致病基因KRT9R163W17-60
• 研究內(nèi)容與方法17-23
• 實驗方法23-33
• 結(jié)果33-48
• 討論48-59
• 小結(jié)59-60
• 第二部分：KRT9R163W基因突變表達對角質(zhì)形成細胞（HaCaT）細胞骨架的影響研究60-83
• 實驗材料60-62
• 實驗方法62-73
• 結(jié)果73-77
• 討論77-82
• 小結(jié)82-83
• 第三部分：角蛋白在表皮松解性掌跖角化癥中的表達研究83-109
• 研究內(nèi)容與方法83-89
• 統(tǒng)計學(xué)分析89
• 結(jié)果89-92
• 討論92-108
• 小結(jié)108-109
• 結(jié)論109-111
• 致謝111-112
• 參考文獻112-133
• 綜述 全基因組外顯子測序在單基因病中研究進展133-138
• 參考文獻136-138
• 攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文138-139
• 個人簡歷139-140
• 導(dǎo)師評閱表140

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 Azali Azlan;Najat Dzaki;Ghows Azzam;;Argonaute:The executor of small RNA function[J];Journal of Genetics and Genomics;2016年08期

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本文編號：817324