本文關(guān)鍵詞：尋常型銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞及HaCaT細(xì)胞株糖酵解的初步研究

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【摘要】：目的：尋常型銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚病,具有表皮增殖過度、角化不全、真皮淺層毛細(xì)血管擴(kuò)張及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)等特征,其表皮與惡性腫瘤存在細(xì)胞過度增殖和局域性缺氧等共同特點(diǎn)。缺氧誘導(dǎo)因子-1α (Hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)在腫瘤中能激活大部分糖酵解相關(guān)酶從而促使細(xì)胞代謝主要朝糖酵解方向進(jìn)行。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)CD147分子在銀屑病患者皮損區(qū)及外周血細(xì)胞中高表達(dá),并且是銀屑病的易感基因之一,我們還發(fā)現(xiàn)CD147在惡性黑素瘤糖酵解過程中發(fā)揮重要作用,同時(shí)也能在HIF-1α的調(diào)節(jié)下介導(dǎo)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。本文旨在探討在尋常型銀屑病和人類永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞株中,HIF-1α、CD147及糖酵解相關(guān)蛋白可能發(fā)揮的作用及相互關(guān)系,為進(jìn)一步揭示銀屑病的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。 方法：1、免疫組化法分析HIF-1α、CD147、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體1(Glucose Transporter1, GLUT1)、糖酵解關(guān)鍵酶己糖激酶(Hexokinase2, HK2)、丙酮酸激酶(Pyruvate kinase2, PKM2)在尋常型銀屑病皮損區(qū)及正常人表皮中的表達(dá)及分布,并行相關(guān)性分析； 2、構(gòu)建小分子干擾片段RNA (Small interfering RNA, siRNA)并在HaCaT細(xì)胞中干擾HIF-1α蛋白表達(dá),Western Blot檢測(cè)HIF-1α、 CD147、GLUT1、HK2、PKM2蛋白表達(dá)的變化； 3、CoCl2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞化學(xué)缺氧,Western Blot檢測(cè)HIF-1α、 CD147、 GLUT1、HK2、PKM2蛋白表達(dá)的變化； 4、免疫熒光共聚焦法檢測(cè)CD147和GLUT1蛋白在銀屑病皮損表皮中表達(dá)的共定位； 5、siRNA干擾/過表達(dá)HaCaT細(xì)胞中CD147蛋白,Western Blot檢測(cè)CD147、GLUT1蛋白表達(dá)的變化； 6、siRNA干擾/過表達(dá)HaCaT細(xì)胞中GLUT1蛋白, Western Blot檢測(cè)GLUT1、CD147蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果：1、 HIF-lα、CD147、GLUT1、HK2、PKM2蛋白均在尋常型銀屑病皮損區(qū)較正常人表皮表達(dá)增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); 2、尋常型銀屑病皮損中HIF-1α CD147與GLUT1蛋白的表達(dá)兩兩存在正相關(guān)性(P0.05), HK2、PKM2與其它指標(biāo)均無相關(guān)性(P0.05)； 3、HaCaT細(xì)胞中干擾HIF-1α表達(dá)后,HIF-1α、CD147、GLUT1及HK2蛋白表達(dá)均顯著下降(P0.05), PKM2表達(dá)無明顯差異(P0.05); 4, CoCl2誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞化學(xué)缺氧后,HIF-1α、CD147、GLUT1及HK2蛋白表達(dá)均顯著上升(P0.05),PKM2的表達(dá)無明顯差異(P0.05)； 5、CD147和GLUT1蛋白在尋常型銀屑病皮損區(qū)表達(dá)具有共定位現(xiàn)象,均分布在基底層細(xì)胞及棘層部分細(xì)胞的細(xì)胞膜上； 6、在HaCaT細(xì)胞中分別干擾和過表達(dá)CD147蛋白后,GLUT1蛋白的表達(dá)無明顯差異(P0.05)； 7、在HaCaT細(xì)胞中分別干擾和過表達(dá)GLUT1蛋白后,CD147蛋白的表達(dá)無明顯差異(P0.05)。 結(jié)論：1、尋常型銀屑病患者角質(zhì)形成細(xì)胞中糖酵解能力可能較正常人升高;2、缺氧誘導(dǎo)了HaCaT細(xì)胞中HIF-lα水平升高,進(jìn)一步上調(diào)CD147、GLUT1和HK2蛋白的表達(dá),可能增強(qiáng)了HaCaT細(xì)胞的糖酵解能力。
【關(guān)鍵詞】：銀屑病 糖酵解 缺氧 HIF-1α HaCaT
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R758.63
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 目錄10-12
• 主要~.略詞表12-13
• 前言13-16
• 1 材料與方法16-27
• 1.1 材料16-20
• 1.1.1 主要試劑16-17
• 1.1.2 主要耗材17-18
• 1.1.3 主要儀器18-19
• 1.1.4 主要試劑的配制19-20
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法20-26
• 1.2.1 組織標(biāo)本收集20
• 1.2.2 細(xì)胞株20
• 1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)20-21
• 1.2.4 siRNA轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞21-22
• 1.2.5 質(zhì)粒提取22
• 1.2.6 空載及CD147質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞22-23
• 1.2.7 CoCl_2誘導(dǎo)HaCaT缺氧23
• 1.2.8 目的蛋白質(zhì)提取23
• 1.2.9 免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)目的蛋白表達(dá)水平23-24
• 1.2.10 免疫組化24-25
• 1.2.11 組織免疫熒光25-26
• 1.3 免疫組化評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)26
• 1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法26-27
• 2 結(jié)果27-36
• 2.1 HIF-1α、CD147及糖酵解相關(guān)重要蛋白在尋常型銀屑病患者皮損區(qū)和正常人皮膚表皮中的差異性表達(dá)27-32
• 2.2 在HaCaT細(xì)胞中干擾HIF-1α表達(dá)對(duì)CD147、GLUT1、HK2及PKM2蛋白表達(dá)的影響32-33
• 2.3 在HaCaT細(xì)胞中上調(diào)HIF-1α表達(dá)對(duì)CD147、GLUT1、HK2及PKM2蛋白表達(dá)的影響33-34
• 2.4 尋常型銀屑病皮損中CD147和GLUT1蛋白的共定位34-35
• 2.5 HaCaT細(xì)胞中干擾和過表達(dá)CD147蛋白對(duì)GLUT1表達(dá)的影響35
• 2.6 HaCaT細(xì)胞中干擾和過表達(dá)GLUT1蛋白對(duì)CD147表達(dá)的影響35-36
• 3 討論36-39
• 3.1 角質(zhì)形成細(xì)胞中復(fù)雜的糖酵解機(jī)制36
• 3.2 HIF-1α對(duì)CD147和GLUT1的調(diào)控36-37
• 3.3 糖酵解在銀屑病中的意義37-38
• 3.4 總結(jié)38-39
• 結(jié)論39-40
• 參考文獻(xiàn)40-44
• 綜述44-53
• 參考文獻(xiàn)49-53
• 攻讀學(xué)位期間參與課題及所獲獎(jiǎng)勵(lì)53-54
• 致謝54

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