發(fā)布時(shí)間：2017-09-01 23:10

  本文關(guān)鍵詞：VEGF與P21活化激酶1信號(hào)通路相互作用在銀屑病致病機(jī)制中的研究

  更多相關(guān)文章： 銀屑病 p-PAK1 VEGF PASI Hacat細(xì)胞 PAK1 p-PAK1 VEGF 質(zhì)粒 PAK1 VEGF MTT 流式細(xì)胞學(xué)

【摘要】：第一部分 p-PAK1及VEGF在銀屑病中的表達(dá)及其相關(guān)性 目的研究p-PAK1及VEGF在銀屑病中的表達(dá),并探討p-PAK1與臨床PASI及VEGF的相關(guān)性。 方法臨床收集銀屑病組織標(biāo)本,分別記錄臨床PASI評(píng)分,同時(shí)選用正常皮膚標(biāo)本作為對(duì)照組,采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)銀屑病石蠟標(biāo)本中p-PAK1及VEGF的表達(dá),并用Image-pro Plus6.0進(jìn)行半定量分析；運(yùn)用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)銀屑病新鮮組織標(biāo)本中p-PAK1及VEGF的表達(dá),并用Quantity one對(duì)蛋白表達(dá)進(jìn)行半定量分析；應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析檢測(cè)p-PAK1與PASI、p-PAK1與VEGF之間的相關(guān)性。 結(jié)果 1.免疫組織化學(xué)檢測(cè)示p-PAK1及VEGF在銀屑病皮損中的表達(dá)量即平均光密度值及平均陽性面積均明顯高于正常皮膚組(p0.05)。 2.蛋白免疫印跡檢測(cè)示p-PAK1及VEGF在銀屑病皮損中的表達(dá)量即相對(duì)蛋白水平均明顯高于正常皮膚組(p0.05)。 3. p-PAK1在銀屑病中的表達(dá)量與臨床PASI值之間存在明顯正相關(guān)性(p0.05)。 4. p-PAK1與VEGF在銀屑病皮損中的表達(dá)具有明顯正相關(guān)性(p0.05)。 結(jié)論P(yáng)AK1信號(hào)通路在銀屑病皮損中出現(xiàn)過度活化現(xiàn)象,p-PAK1在銀屑病中過量表達(dá),p-PAK1可能參與疾病的發(fā)生和發(fā)展；PAK1信號(hào)通路可能與VEGF相互作用共同參與銀屑病的疾病進(jìn)程。 第二部分 PAK1信號(hào)通路調(diào)節(jié)VEGF在Hacat細(xì)胞中的表達(dá) 目的通過在Hacat角質(zhì)形成細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV6M-PAK1-T423E和pCMV6M-PAK1-K299R,探討分別激活及抑制PAK1信號(hào)通路活性后對(duì)VEGF的表達(dá)量的影響。方法抽提質(zhì)粒pCMV6M-PAK1-T423E和pCMV6M-PAK1-K299R后,體外轉(zhuǎn)染Hacat細(xì)胞,分別于轉(zhuǎn)染后18h、24h、30h采用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)p-PAK1的表達(dá),同時(shí)運(yùn)用Real-Time PCR、蛋白免疫印跡及ELISA等方法分別從mRNA水平及蛋白水平檢測(cè)VEGF表達(dá)量的變化。 結(jié)果 1.質(zhì)粒pCMV6M-PAK1-T423E和pCMV6M-PAK1-K299R成功轉(zhuǎn)染到Hacat細(xì)胞,激活和抑制PAK1后,分別增加和降低p-PAK1的表達(dá)量(p0.05)。 2. Hacat細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV6M-PAK1-T423E后,可從mRNA水平、蛋白水平增加VEGF的表達(dá)(p0.05)。 3. Hacat細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pCMV6M-PAK1-K299R后,可從mRNA水平、蛋白水平降低VEGF的表達(dá)(p0.05)。 4. pCMV6M-PAK1-T423E轉(zhuǎn)染Hacat細(xì)胞后24h達(dá)到最大活性,而pCMV6M-PAK1-K299R轉(zhuǎn)染Hacat細(xì)胞后30h達(dá)到最大活性。 結(jié)論P(yáng)AK1信號(hào)通路調(diào)節(jié)VEGF在Hacat細(xì)胞中的表達(dá),激活PAK1可提高VEGF的表達(dá),而抑制PAK1可降低VEGF表達(dá)。提示PAK1信號(hào)通路可能通過調(diào)節(jié)VEGF的表達(dá)量,參與銀屑病的發(fā)生及發(fā)展過程。 第三部分 VEGF激活PAK1信號(hào)通路及VEGF對(duì)Hacat細(xì)胞生物學(xué)行為的影響 目的探討在Hacat細(xì)胞中VEGF對(duì)PAK1信號(hào)通路活性的影響,觀察VEGF可否通過PAK1信號(hào)通路介導(dǎo)自分泌,同時(shí)觀察VEGF對(duì)Hacat細(xì)胞生物學(xué)行為的影響,進(jìn)一步探討PAK1信號(hào)通路與VEGF之間的相關(guān)性。 方法用VEGF細(xì)胞因子作用于Hacat細(xì)胞后,應(yīng)用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)PAK1信號(hào)通路活性的改變,同時(shí)用不同濃度Ong/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml VEGF細(xì)胞因子刺激作用細(xì)胞,運(yùn)用MTT、流式細(xì)胞學(xué)方法檢測(cè)其對(duì)Hacat細(xì)胞增殖及凋亡的影響。 結(jié)果VEGF作用于Hacat細(xì)胞,激活PAK1信號(hào)通路,p-PAK1相對(duì)蛋白表達(dá)水平明顯升高(p0.05)：細(xì)胞因子刺激作用細(xì)胞后,可以促進(jìn)細(xì)胞增殖,抑制細(xì)胞凋亡,且隨著VEGF濃度的增高,作用逐漸明顯并呈現(xiàn)濃度依賴性。 結(jié)論在Hacat細(xì)胞中,VEGF激活PAK1信號(hào)通路,PAK1信號(hào)通路活化后,增加VEGF的表達(dá),VEGF可能通過PAK1信號(hào)通路促進(jìn)自身在角質(zhì)形成細(xì)胞中的自分泌過程,從而進(jìn)一步明確了在銀屑病中PAK1信號(hào)通路過度活化與VEGF的關(guān)系,也為銀屑病的治療提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：銀屑病 p-PAK1 VEGF PASI Hacat細(xì)胞 PAK1 p-PAK1 VEGF 質(zhì)粒 PAK1 VEGF MTT 流式細(xì)胞學(xué)
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R758.63
【目錄】：

• 縮寫詞及中英文對(duì)照6-9
• 中文摘要9-12
• ABSTRACT12-15
• 前言15-18
• 主要材料與試劑18-21
• 主要儀器與器材21-22
• 第一部分 P-PAK1及VEGF在銀屑病中的表達(dá)及其相關(guān)性22-37
• 實(shí)驗(yàn)方法23-29
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-35
• 討論35-37
• 第二部分 PAK1信號(hào)通路調(diào)節(jié)VEGF在HACAT細(xì)胞中的表達(dá)37-54
• 實(shí)驗(yàn)方法38-45
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-52
• 討論52-54
• 第三部分 VEGF激活PAK1信號(hào)通路及VEGF對(duì)HACAT細(xì)胞的生物學(xué)作用54-63
• 實(shí)驗(yàn)方法55-58
• 實(shí)驗(yàn)結(jié)果58-61
• 討論61-63
• 全文小結(jié)63-64
• 綜述 銀屑病發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展64-74
• 參考文獻(xiàn)74-87
• 附錄 在校期間所發(fā)表的文章87-88
• 致謝88-89

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