發(fā)布時(shí)間：2017-09-01 14:27

  本文關(guān)鍵詞：慢病毒載體初免和牛痘病毒載體加強(qiáng)免疫對(duì)黑色素瘤的預(yù)防和治療作用的研究

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【摘要】：疫苗在抗微生物免疫中取得的巨大成功使得人們開始考慮是否可以用同樣的思路來治療腫瘤。早在1902年Leyden和Blumentha就嘗試將腫瘤細(xì)胞疫苗用于治療病人,但結(jié)果并不樂觀。1959年Graham使用自身腫瘤疫苗治療了232例婦科腫瘤患者,結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然自身疫苗可用于治療患者,少見不良反應(yīng),但并不能改變疾病自然病程。盡管經(jīng)歷了挫折和失敗,但人們一直沒有放棄對(duì)腫瘤疫苗的研究。隨著人類腫瘤特異性抗原(Tumor Specific Antigen, TSA)和相關(guān)抗原(Tumor Associated Antigen, TAA)被證實(shí)及其基因克隆的成功,腫瘤的主動(dòng)免疫治療再次受到重視,腫瘤疫苗的研究被推向高潮。腫瘤疫苗通過主動(dòng)免疫誘導(dǎo)機(jī)體特異性細(xì)胞免疫和體液免疫反應(yīng),發(fā)揮特異性殺傷與清除作用,達(dá)到治療腫瘤的作用。與用于預(yù)防傳染病的經(jīng)典疫苗不同的是,腫瘤疫苗一般為治療性疫苗,由于腫瘤免疫抑制性微環(huán)境的存在和腫瘤抗原的低免疫原性使得腫瘤疫苗誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)非常有限,提示我們應(yīng)該開發(fā)更好的抗原運(yùn)載系統(tǒng)以在免疫抑制性的環(huán)境內(nèi)誘導(dǎo)出更強(qiáng)的抗弱免疫原性腫瘤抗原的效應(yīng)性免疫反應(yīng)。利用重組病毒載體表達(dá)腫瘤抗原誘導(dǎo)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)是非常有效的方法之一。 重組牛痘病毒載體(vaccinia virus vector, vv)是第一批用于治療腫瘤的基因載體,vv具有幾個(gè)突出的優(yōu)點(diǎn)：免疫原性強(qiáng)；能夠運(yùn)載較長的基因片段；可感染小鼠和人的所有細(xì)胞；具有直接溶瘤效應(yīng)；安全性良好,不會(huì)整合到宿主基因中去；易于制備高濃度的病毒顆粒。因此,vv作為有效實(shí)用的病毒載體被廣泛用于抗感染和抗腫瘤研究中。例如,有研究者利用vv表達(dá)gp160,誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗HIV免疫反應(yīng),vv表達(dá)HPV則可誘導(dǎo)抗HPV特異性免疫反應(yīng)；還有很多報(bào)道利用vv表達(dá)細(xì)胞因子如GM-CSF或者腫瘤相關(guān)抗原如CEA用于抗腫瘤治療。但vv載體部分的高免疫原性限制了攜帶的目的抗原部分的免疫反應(yīng)。慢病毒載體(lentiviral vector, lv)只表達(dá)目標(biāo)抗原,因而誘導(dǎo)出的免疫反應(yīng)以針對(duì)目標(biāo)抗原為主,而針對(duì)載體部分的免疫卻較弱,因而特別適合用于運(yùn)載腫瘤抗原的病毒載體。而且,1v能夠轉(zhuǎn)染非分裂性(non-dividing)的樹突狀細(xì)胞(Dendritic cells, DCs),轉(zhuǎn)染后的DCs將1v攜帶表達(dá)的腫瘤抗原有效遞呈給免疫細(xì)胞,啟動(dòng)一系列免疫反應(yīng)；另外,1v能夠誘導(dǎo)持續(xù)性的抗原表達(dá),進(jìn)而誘導(dǎo)持續(xù)性的免疫反應(yīng)。將表達(dá)黑色素瘤相關(guān)抗原如NY-ESO,酪氨酸酶相關(guān)蛋白1(Tyrosinase-related protein1,TRP1)的1v直接免疫小鼠,機(jī)體可產(chǎn)生很強(qiáng)的抗腫瘤抗原特異性免疫反應(yīng),并能抑制腫瘤生長。 然而,盡管vv和1v是非常優(yōu)秀的腫瘤疫苗病毒載體,但單一應(yīng)用療效有限。我們考慮,這和它們誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)強(qiáng)度和質(zhì)量有關(guān)。傳統(tǒng)的疫苗免疫一般是相同疫苗多次免疫以誘導(dǎo)再次免疫應(yīng)答并增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)。但機(jī)體產(chǎn)生的抗載體免疫影響了目標(biāo)免疫反應(yīng)。近十幾年以來,有很多報(bào)道證明,利用表達(dá)相同抗原的不同載體來加強(qiáng)免疫能夠誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫反應(yīng),能夠更有效地治療腫瘤。所以我們考慮,將1v和vv這兩個(gè)不同的載體聯(lián)合應(yīng)用也許能夠誘導(dǎo)更強(qiáng)更有效的免疫反應(yīng),從而提高預(yù)防和治療腫瘤的作用。 因此,本研究分別構(gòu)建了表達(dá)人黑色素瘤相關(guān)抗原gp100(glycoprotein100, gp100O)的1v和vv,并制備了用于免疫小鼠的病毒顆粒。以小鼠黑色素瘤為腫瘤模型,研究聯(lián)合應(yīng)用hgp100-lv和hgp100-vv對(duì)黑色素瘤的預(yù)防和治療作用。全部工作分為三個(gè)部分簡(jiǎn)述如下。 一、表達(dá)人黑色素瘤相關(guān)抗原gp100的重組1v和vv構(gòu)建及誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的初步鑒定 基于目前對(duì)異源性DNA疫苗誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)優(yōu)于同源性DNA疫苗的共識(shí),本研究采用了人黑色素瘤相關(guān)抗原gp100為目的抗原,利用常規(guī)高保真PCR技術(shù)將人gp100基因的N-末端的340個(gè)氨基酸基因片段克隆到慢病毒載體上,成功構(gòu)建了表達(dá)人黑色素瘤相關(guān)抗原gp100的重組慢病毒載體hgp100-lv,同時(shí)也構(gòu)建了表達(dá)人gp100的pG10載體hgp100-pG10。hgp100-lv DNA經(jīng)磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染人293T細(xì)胞,hgp100-lv病毒顆粒釋放到上清中,經(jīng)收集和濃縮上清,成功獲得可用于小鼠免疫的病毒顆粒,濃度可達(dá)1～5×109Tu/ml。應(yīng)用hgp100-pG10載體和WR系(Western Reserve strain)的Vaccinia virus經(jīng)同源重組法制備出hgp100-vv病毒顆粒,濃度也可達(dá)1～5×109Tu/ml。經(jīng)小鼠體內(nèi)免疫接種證實(shí),hgp100-lv比hgp100-vv能夠誘導(dǎo)更多的gp100特異性Pmel-1細(xì)胞(Thy1.1+CD8+)增殖,并能誘導(dǎo)更強(qiáng)的內(nèi)源性CD8免疫反應(yīng),即小鼠外周血單個(gè)核細(xì)胞在hgp100多肽的刺激下分泌IFNy的CD8+細(xì)胞比例增高；而且hgp100-lv誘導(dǎo)的特異性CD8+T細(xì)胞能夠識(shí)別小鼠gp100(mgp100)。 本部分工作成功獲得了能夠誘導(dǎo)小鼠機(jī)體特異性免疫反應(yīng)的的hgp100-lv和hgp100-vv的病毒顆粒,hgp100-lv誘導(dǎo)特異性CD8+T細(xì)胞反應(yīng)優(yōu)于hgp100-vv。 二、hgp100-lv初免、hgp100-vv加強(qiáng)免疫對(duì)黑色素瘤的預(yù)防作用 迄今為止,多數(shù)腫瘤疫苗主要是用于腫瘤的治療,亦稱為治療性疫苗。而在本研究中,我們對(duì)hgp100-lv和hgp-100-vv疫苗是否能夠預(yù)防黑色素瘤的發(fā)生進(jìn)行了初步觀察。給予小鼠進(jìn)行hgp100-lv足墊免疫接種的結(jié)果顯示：在免疫反應(yīng)高峰期,即1v接種后10到14天時(shí),小鼠外周血中約有5-10%的CD8T細(xì)胞可特異性分泌IFNγ。利用hgp100225-23四聚體(tetramer)染色發(fā)現(xiàn)40%的CD8+T細(xì)胞是四聚體陽性的,并且這部分細(xì)胞中有20%表達(dá)CD127,提示它們是記憶前體細(xì)胞,由此證實(shí)了1v有較強(qiáng)的誘導(dǎo)免疫記憶反應(yīng)的活性。1v初免后30到40天,小鼠外周血中特異性CD8+T細(xì)胞數(shù)目趨于穩(wěn)定,約2%的CD8+T細(xì)胞能夠特異性分泌IFNγ。此時(shí)于腹腔注射vv加強(qiáng)免疫(1v-vv,即1v初免-VV加強(qiáng)免疫)能夠誘導(dǎo)很強(qiáng)的再次免疫應(yīng)答,明顯增強(qiáng)外周血免疫反應(yīng),表現(xiàn)為在vv加強(qiáng)免疫后的5到10天外周血白細(xì)胞于體外經(jīng)hgp100多肽刺激后有15%的CD8+T細(xì)胞能夠分泌IFNγ,而vv-1v(vv初免-1v加強(qiáng)免疫)組只有5%可分泌IFNγ,和1v單獨(dú)免疫時(shí)高峰期效應(yīng)一致。lv-lv (lv初免-1v加強(qiáng)免疫)組也和1v單獨(dú)免疫組效果相似。更重要的現(xiàn)象是,1v-vv誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)持續(xù)時(shí)間長,甚至在加強(qiáng)免疫后兩個(gè)月外周血中依然可檢出5%的CD8+T細(xì)胞能夠特異性分泌IFNγ;而1v免疫組和vv-1v免疫組均只有1%左右。1v-vv的免疫方法明顯增強(qiáng)了小鼠外周血中g(shù)p100特異性CD8+T細(xì)胞的總數(shù)目,也增加了外周血中記憶性CD8+T細(xì)胞數(shù)目。令人驚奇的是,1v-vv誘導(dǎo)的CD8+T細(xì)胞能夠快速識(shí)別進(jìn)入機(jī)體的腫瘤細(xì)胞,迅速被再次激活和增殖,產(chǎn)生效應(yīng),清除腫瘤細(xì)胞,達(dá)到有效預(yù)防黑色素瘤作用。 通過應(yīng)用中和抗體清除不同細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)在這種保護(hù)作用中,CD8+細(xì)胞起主導(dǎo)作用,但CD4+細(xì)胞也參與了這種預(yù)防作用。此外,無論是1v初免抑或vv加強(qiáng)免疫之前清除CD4+細(xì)胞,1v-vv免疫接種誘導(dǎo)的CD8初次免疫反應(yīng)和再次免疫反應(yīng)均明顯降低。提示此系統(tǒng)中CD8初次免疫反應(yīng)和再次免疫反應(yīng)均需要CD4+細(xì)胞的幫助。更重要的是,應(yīng)用小鼠自發(fā)腫瘤模型證實(shí)hgp100-lv-hgp100-vv初次免疫一加強(qiáng)免疫的方法能夠有效預(yù)防原發(fā)性黑色素瘤,從而證明1v-vv的免疫方法能夠有效預(yù)防腫瘤。 本部分研究證明,與其它免疫方式比較,1v-vv免疫能夠誘導(dǎo)更強(qiáng)的(再次)免疫反應(yīng),包括特異性CD8+T細(xì)胞增殖反應(yīng)增強(qiáng)及免疫記憶細(xì)胞增加,并能夠快速感應(yīng)腫瘤細(xì)胞的出現(xiàn)并將其清除,因而能夠有效預(yù)防黑色素瘤的形成與發(fā)展。 三、腫瘤局部誘導(dǎo)急性炎癥對(duì)hgp100-lv免疫的腫瘤浸潤效應(yīng)細(xì)胞功能和黑色素瘤治療效果的影響作用研究 近期研究包括我們的前期工作表明腫瘤疫苗對(duì)實(shí)體瘤的療效有限,因而應(yīng)用受限的主要原因之一是腫瘤微環(huán)境導(dǎo)致浸潤到腫瘤組織的T細(xì)胞即腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞(TIL)不能有效發(fā)揮其免疫效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)室前期研究也證明了此現(xiàn)象的存在。然而急性感染組織灶中的抗原特異性免疫細(xì)胞卻能使感染迅速清除。因此,我們提出假設(shè)：腫瘤組織引入微生物建立急性炎癥環(huán)境有可能恢復(fù)TIL細(xì)胞的抗腫瘤免疫效應(yīng)。所采用措施是選擇對(duì)人體安全的溶瘤型牛痘病毒載體,旨在觀察牛痘病毒載體能否恢復(fù)腫瘤微環(huán)境中TIL細(xì)胞功能。 本研究采用小鼠皮下種植0.3×106小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16細(xì)胞,生長5天呈進(jìn)展期的黑色素瘤模型。以hgp100-lv足墊免疫接種,在1v免疫反應(yīng)效應(yīng)期(1v免疫后7天。免疫反應(yīng)始能檢測(cè)到)于腫瘤局部或腹腔內(nèi)注射hgp100-vv,然后觀察腫瘤的生長情況,并在加強(qiáng)免疫后6到10天分析腫瘤微環(huán)境。結(jié)果顯示,hgp100-lv初免,效應(yīng)期hgp100-vv (i. p.)加強(qiáng)免疫也能夠增強(qiáng)小鼠的系統(tǒng)免疫反應(yīng),并且能夠增加腫瘤內(nèi)CD8+和CD4+細(xì)胞浸潤,但該措施對(duì)進(jìn)展期腫瘤的治療作用并沒有顯著提高；而hgp100-lv初免后,效應(yīng)期腫瘤內(nèi)注射(i.t.)hgp100-vv并不能增強(qiáng)系統(tǒng)免疫反應(yīng),也不能增加腫瘤內(nèi)CD8+和CD4+細(xì)胞浸潤,但hgp100-vv (i. t.)的加強(qiáng)免疫能夠恢復(fù)腫瘤內(nèi)效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的功能,同時(shí)降低Treg的比例,顯著增強(qiáng)對(duì)進(jìn)展期腫瘤的治療效果。 為作進(jìn)一步的機(jī)制探討,我們應(yīng)用具有相似作用的PolyI:C/CpG (i.t.)以排除vv溶瘤作用的干擾。PolyI:C/CpG為Toll樣受體(TLR)激動(dòng)劑,同樣能誘導(dǎo)瘤內(nèi)急性炎癥環(huán)境,且已有很多報(bào)道證明它們具有促進(jìn)腫瘤治療作用。hgp100-lv足墊初免后,效應(yīng)期PolyI:C/CpG (i.t.)也不能增加腫瘤內(nèi)CD8+細(xì)胞和CD4+細(xì)胞的浸潤,同時(shí)也能夠恢復(fù)腫瘤內(nèi)效應(yīng)性CD8+T細(xì)胞的功能,降低瘤內(nèi)Treg浸潤,并增強(qiáng)對(duì)進(jìn)展期腫瘤的治療作用。機(jī)制上,hgp100-vv(i. t.)和PolyⅠ:C/CpG (i.t.)誘導(dǎo)腫瘤內(nèi)產(chǎn)生的I型IFN起關(guān)鍵作用。PolyⅠ:C/CpG作用于基因敲除I型IFN受體的小鼠,其腫瘤內(nèi)T細(xì)胞功能并不能被恢復(fù)；而且PolyⅠ:C/CpG (i.t.)也不能增強(qiáng)hgp100-lv免疫接種的腫瘤治療作用。此外,PolyⅠ:C/CpG可激活腫瘤內(nèi)浸潤的DC細(xì)胞(TIDCs),表現(xiàn)為PolyⅠ:C/CpG(i.t.)處理過的TIDCs表達(dá)更高水平的CD40, CD86等DCs成熟分子標(biāo)志,并具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖能力。激活的TIDCs在腫瘤原位再次激活hgp100-lv激活的CD8+T細(xì)胞,恢復(fù)CD8+T細(xì)胞的功能,進(jìn)一步促進(jìn)對(duì)腫瘤的治療作用。 本部分研究表明,1v初免后,效應(yīng)期利用vv或者PolyⅠ:C/CpG于腫瘤局部誘導(dǎo)急性炎癥反應(yīng)能夠恢復(fù)腫瘤內(nèi)T細(xì)胞的功能,降低Treg細(xì)胞的浸潤,增強(qiáng)1v初免對(duì)腫瘤的治療作用。 綜上,本研究證明Iv初免-vv加強(qiáng)的免疫方式可以誘導(dǎo)更強(qiáng)更有效的免疫反應(yīng),包括特異性CD8T細(xì)胞增殖反應(yīng)增強(qiáng)及免疫記憶細(xì)胞增加,并能夠快速感應(yīng)腫瘤細(xì)胞的出現(xiàn)并將其清除,因而能夠有效預(yù)防黑色素瘤的形成與發(fā)展；Iv初免后,效應(yīng)期vv(i.t.)或者PolyⅠ:C/CpG(i.t.)誘導(dǎo)的腫瘤局部急性炎癥能夠恢復(fù)腫瘤內(nèi)腫瘤特異性CD8T細(xì)胞功能,降低瘤內(nèi)Treg的浸潤,從而增強(qiáng)1V對(duì)實(shí)體黑色素瘤的治療作用,為腫瘤的預(yù)防和治療提供了新的方法和理論借鑒。本研究首次報(bào)告Iv-vv誘導(dǎo)的記憶性CD8+T細(xì)胞能夠快速感應(yīng)和清除腫瘤細(xì)胞,有效預(yù)防腫瘤,且有效期顯著長于用其它方法誘導(dǎo)的預(yù)防作用,本研究觀察了1v-vv對(duì)腫瘤的長期預(yù)防作用,觀察時(shí)間達(dá)一年；我們還發(fā)現(xiàn)CD4+細(xì)胞對(duì)hgp100-lv誘導(dǎo)的CD8再次免疫反應(yīng)也有幫助作用,這和現(xiàn)在的普遍觀點(diǎn)不同。本研究還首次提出了誘導(dǎo)腫瘤局部急性炎癥可以促進(jìn)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞功能,從而促進(jìn)對(duì)腫瘤的治療作用。
【關(guān)鍵詞】：慢病毒載體(1v) 牛痘病毒載體(vv) 黑色素瘤 CD8T細(xì)胞 免疫反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 前言18-25
• 第一章 表達(dá)人黑色素瘤相關(guān)抗原gp100的重組1v和vv構(gòu)建及誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的初步鑒定25-37
• 1.1 材料和方法25-31
• 1.2 結(jié)果31-35
• 1.3 討論35-36
• 1.4 小結(jié)36-37
• 第二章 hgp100-1v初免、hgp100-vv加強(qiáng)免疫對(duì)黑色素瘤的預(yù)防作用研究37-56
• 2.1 材料和方法37-41
• 2.2 結(jié)果41-53
• 2.3 討論53-55
• 2.4 小結(jié)55-56
• 第三章 腫瘤局部誘導(dǎo)急性炎癥對(duì)hgp100-1v免疫的腫瘤浸潤效應(yīng)細(xì)胞功能和黑色素瘤治療效果的影響作用研究56-87
• 3.1 材料和方法56-65
• 3.2 結(jié)果65-82
• 3.3 討論82-85
• 3.4 小結(jié)85-87
• 全文總結(jié)87-89
• 參考文獻(xiàn)89-96
• 在讀期間發(fā)表及待發(fā)表的文章96-98
• 中英文對(duì)照縮略詞語表98-101
• 致謝101-104
• 統(tǒng)計(jì)學(xué)審稿證明104

【共引文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 張譯文;羅海華;張旭;張輝;劉超;;維生素C對(duì)CD4~+效應(yīng)記憶性T細(xì)胞體外擴(kuò)增的影響[J];中國病理生理雜志;2013年08期

2 張亮;張斌;麥海星;陳立軍;;腫瘤浸潤未成熟樹突狀細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成的研究進(jìn)展[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2013年13期

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 杜漸;胰腺癌BxPC-3細(xì)胞上清液通過上調(diào)樹突狀細(xì)胞miRNA-146a的表達(dá)抑制其成熟及免疫功能的研究[D];大連醫(yī)科大學(xué);2012年

2 葛科立;依賴hTERT啟動(dòng)子的新型溶瘤單純皰疹病毒的構(gòu)建和功能研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2013年

3 劉存霞;雞痘病毒282E4株基因組和蛋白質(zhì)組解析、載體構(gòu)建與HIV重組疫苗研究[D];吉林大學(xué);2013年

4 丁凱;免疫相關(guān)性全血細(xì)胞減少癥患者骨髓造血細(xì)胞膜靶抗原的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2013年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 潘晨琛;Cre重組酶介導(dǎo)的神經(jīng)元條件死亡系統(tǒng)的構(gòu)建及應(yīng)用[D];蘭州大學(xué);2013年

2 姜榮芝;四種雞球蟲多價(jià)DNA疫苗免疫程序及其穩(wěn)定性研究[D];南京農(nóng)業(yè)大學(xué);2012年

3 譚章平;GP96_(NTD)-CSP重組DNA瘧疾疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生保護(hù)性免疫及遺傳減毒子孢子的構(gòu)建[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2013年

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本文編號(hào)：772624