本文關(guān)鍵詞：銀屑病HLA-Cw6相關(guān)miRNAs的篩選及其作用機制研究

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【摘要】：背景： 銀屑病(Psoriasis, PS)是一種以表皮細胞過度增殖及炎癥為特征的慢性反復發(fā)性疾病。運用全基因組關(guān)聯(lián)分析對銀屑病易感基因研究顯示HLA-Cw6是與銀屑病免疫反應相關(guān)性最強的MHC易感基因,IL12B和IL23R是兩個與炎癥反應密切關(guān)聯(lián)的非MHC易感基因,LCE3A和LCE3D編碼異常角質(zhì)化包膜蛋白。我項目組研究發(fā)現(xiàn)在銀屑病的皮損和血液中存在大量差異表達的niRNAs,但其在銀屑病發(fā)病進而病情進展中的具體機制尚不明確�，F(xiàn)如今大多數(shù)研究僅局限在單個miRNAs和易感基因的研究上,隨著系統(tǒng)生物學的發(fā)展,研究miRNAs具體功能以及和易感基因之間的關(guān)系則成為一個新的趨勢。 目的： 本課題系導師楊志波教授多年來在銀屑病等紅斑鱗屑性皮膚病臨床與實驗研究基礎(chǔ)上的拓展和延伸,旨在前期研究的基礎(chǔ)上,運用生物信息學手段,初步構(gòu)建尋常型銀屑病患者差異表達miRNAs與HLA-Cw6、IL12B、IL23R、LCE3A和LCE3D的調(diào)控網(wǎng)絡,并使用熒光實時定量PCR (RT-PCR)方法和原位雜交技術(shù)進行HLA-Cw6相關(guān)miRNAs的驗證；最終通過體外細胞實驗研究與HLA-Cw6相關(guān)miRNAs下游細胞因子及細胞增殖情況的變化。從miRNA與其下游易感基因及細胞因子和細胞增殖的關(guān)系層面探討miRNAs在銀屑病的發(fā)病機制,從而為銀屑病的早期診斷和預后分析提供基礎(chǔ),并在治療層面提供確切藥物靶點和治療靶點。 方法： 首先,根據(jù)前期研究,篩選出與銀屑病密切相關(guān)的易感基因五個,差異表達miRNAs為我前期實驗所得及結(jié)果,利用生物信息學方法,建立其調(diào)控網(wǎng)絡。其次,對所需構(gòu)建的miRNA及基因3’UTR序列進行引物設計、利用PCR擴增目的基因序列、將擴增好的產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳分離及膠回收片段、用XhoI和BamHI雙酶切PCR片段、用XhoI和BamHI雙酶切載體質(zhì)粒pLMP、連接目的片段和載體、細胞培養(yǎng)、細胞轉(zhuǎn)染、熒光素酶活性檢測。最后,培養(yǎng)HacaT細胞,將與HLA-Cw6相關(guān)的miRNAs進行轉(zhuǎn)染或沉默,通過流逝細胞儀的方法觀察下游TNF-α、IL、IL22的表達情況,并記錄HacaT的增殖情況。 結(jié)果： 生物信息學分析顯示可能參與調(diào)控五個易感基因的miRNAs有42個,其中與HLA-Cw6相關(guān)的miRNAs有11個；并采用cytoscape軟件繪制出基因-miRNA網(wǎng)絡調(diào)控圖(miRNA-Gene-Ne).外源性細胞實驗重,經(jīng)過多次驗證,得到miR-222、miR-3188、miR-3162、miR-18b熒光素酶活性下調(diào)最為顯著,隨后進行的突變型熒光素酶報告載體進行共轉(zhuǎn)染中,證實miR-149、miR-18b可直接調(diào)控HLA-CW6基因。最后,將miR-149、miR-18b在HacaT細胞中轉(zhuǎn)染后,兩者對HaCaT細胞都有抑制效果,其中miR-149的抑制效果更強,且隨著作用時間的增強,細胞抑制率提高,同時miR-149對細胞因子TNF-α、IL8、IL22的分泌水平均有一定的抑制作用,而miR-18b則抑制作用較弱,僅對TNF-α抑制作用較明顯。 結(jié)論： 1.通過生物信息學分析,建立繪制出基因-miRNA網(wǎng)絡調(diào)控圖,初步預測miRNAs可能通過調(diào)控易感基因的表達而調(diào)控銀屑病的發(fā)病及病情進展過程。 2.通過雙熒光素酶檢測,得到miR-149、R-18b熒光素酶活性下調(diào)最為顯著,證實了miRNAs可靶向調(diào)控HLA-CW06,進而推測miRNAs可能通過調(diào)控HLA-Cw6來調(diào)控銀屑病發(fā)病、病情進展。 3.通過HaCaT細胞培養(yǎng),miR-149、miR-18b進行轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)miR-149可以使人類永生化細胞產(chǎn)生明顯的細胞活力抑制,同時對細胞因子TNF-α、IL8、IL22的表達均有一定的抑制作用,證實了miR-149對銀屑病發(fā)病及病情進展的作用機制可能與細胞因子有關(guān)。而miR-18b則對細胞活力抑制較弱,并且對IL8、IL22的分泌水平無明顯下調(diào)作用,其作用機制需進一步研究。 4.研究結(jié)果顯示某些miRNAs和其易感基因之間存在某種網(wǎng)絡樣的調(diào)控機制,因此我們推測銀屑病的miRNAs-易感基因-細胞因子之間可能存在著一個大的調(diào)控網(wǎng)絡,并通過整個網(wǎng)絡對銀屑病的發(fā)病、病情演變形成調(diào)控,為下一步開展對銀屑病基因?qū)用嬷委熖峁┝诵碌乃悸芳熬�索。
【關(guān)鍵詞】：銀屑病 MicroRNAs 易感基因 HLA-Cw6 細胞因子
【學位授予單位】：湖南中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R758.63
【目錄】：

• ~.略詞表4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 引言12-16
• 第一部分 尋常型銀屑病差異性表達miRNAs與易感基因的相關(guān)性研究16-33
• 前言16-17
• 1. 材料17-18
• 1.1 設備17
• 1.2 預分析的靶基因17
• 1.3 預分析的miRNA17-18
• 2. 方法18-21
• 2.1 數(shù)據(jù)庫18
• 2.2 登錄數(shù)據(jù)網(wǎng)站,輸入靶基因,搜索預測的miRNA。如圖18-19
• 2.3 HLA-CW06的miRNA預測19-21
• 3. 結(jié)果21-28
• 3.1 易感基因的靶miRNA預測21-25
• 3.2 通過3.1的數(shù)據(jù)分析,我們獲得了備選miRNA與易感基因的作用關(guān)系圖表25-28
• 4 分析與討論28-33
• 第二部分 體外細胞實驗重點驗證相關(guān)MiRNA與HLA-Cw6的相關(guān)性33-58
• 前言33-34
• 1 材料與方法34-45
• 1.1 實驗材料34-36
• 1.2 實驗方法36-45
• 2 結(jié)果45-54
• 3 分析與討論54-58
• 第三部分 miRNA對細胞增殖及細胞因子分泌的影響58-71
• 前言58-59
• 1. 材料59-60
• 2. 方法60-65
• 3. 結(jié)果65-68
• 4 分析與討論68-71
• 結(jié)論71-72
• 致謝72-73
• 參考文獻73-80

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 于世榮;普雄明;;T細胞活化因子與銀屑病[J];中國麻風皮膚病雜志;2008年03期

2 趙奎;龐全海;;MicroRNA研究進展[J];生物技術(shù)通報;2010年12期

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本文編號：761798