本文關(guān)鍵詞：銀屑病HLA-Cw6相關(guān)miRNAs的篩選及其作用機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： 銀屑病 MicroRNAs 易感基因 HLA-Cw6 細(xì)胞因子

【摘要】：背景： 銀屑病(Psoriasis, PS)是一種以表皮細(xì)胞過度增殖及炎癥為特征的慢性反復(fù)發(fā)性疾病。運(yùn)用全基因組關(guān)聯(lián)分析對銀屑病易感基因研究顯示HLA-Cw6是與銀屑病免疫反應(yīng)相關(guān)性最強(qiáng)的MHC易感基因,IL12B和IL23R是兩個(gè)與炎癥反應(yīng)密切關(guān)聯(lián)的非MHC易感基因,LCE3A和LCE3D編碼異常角質(zhì)化包膜蛋白。我項(xiàng)目組研究發(fā)現(xiàn)在銀屑病的皮損和血液中存在大量差異表達(dá)的niRNAs,但其在銀屑病發(fā)病進(jìn)而病情進(jìn)展中的具體機(jī)制尚不明確。現(xiàn)如今大多數(shù)研究僅局限在單個(gè)miRNAs和易感基因的研究上,隨著系統(tǒng)生物學(xué)的發(fā)展,研究miRNAs具體功能以及和易感基因之間的關(guān)系則成為一個(gè)新的趨勢。 目的： 本課題系導(dǎo)師楊志波教授多年來在銀屑病等紅斑鱗屑性皮膚病臨床與實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)上的拓展和延伸,旨在前期研究的基礎(chǔ)上,運(yùn)用生物信息學(xué)手段,初步構(gòu)建尋常型銀屑病患者差異表達(dá)miRNAs與HLA-Cw6、IL12B、IL23R、LCE3A和LCE3D的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR (RT-PCR)方法和原位雜交技術(shù)進(jìn)行HLA-Cw6相關(guān)miRNAs的驗(yàn)證；最終通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究與HLA-Cw6相關(guān)miRNAs下游細(xì)胞因子及細(xì)胞增殖情況的變化。從miRNA與其下游易感基因及細(xì)胞因子和細(xì)胞增殖的關(guān)系層面探討miRNAs在銀屑病的發(fā)病機(jī)制,從而為銀屑病的早期診斷和預(yù)后分析提供基礎(chǔ),并在治療層面提供確切藥物靶點(diǎn)和治療靶點(diǎn)。 方法： 首先,根據(jù)前期研究,篩選出與銀屑病密切相關(guān)的易感基因五個(gè),差異表達(dá)miRNAs為我前期實(shí)驗(yàn)所得及結(jié)果,利用生物信息學(xué)方法,建立其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其次,對所需構(gòu)建的miRNA及基因3’UTR序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)、利用PCR擴(kuò)增目的基因序列、將擴(kuò)增好的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分離及膠回收片段、用XhoI和BamHI雙酶切PCR片段、用XhoI和BamHI雙酶切載體質(zhì)粒pLMP、連接目的片段和載體、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、熒光素酶活性檢測。最后,培養(yǎng)HacaT細(xì)胞,將與HLA-Cw6相關(guān)的miRNAs進(jìn)行轉(zhuǎn)染或沉默,通過流逝細(xì)胞儀的方法觀察下游TNF-α、IL、IL22的表達(dá)情況,并記錄HacaT的增殖情況。 結(jié)果： 生物信息學(xué)分析顯示可能參與調(diào)控五個(gè)易感基因的miRNAs有42個(gè),其中與HLA-Cw6相關(guān)的miRNAs有11個(gè)；并采用cytoscape軟件繪制出基因-miRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖(miRNA-Gene-Ne).外源性細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重,經(jīng)過多次驗(yàn)證,得到miR-222、miR-3188、miR-3162、miR-18b熒光素酶活性下調(diào)最為顯著,隨后進(jìn)行的突變型熒光素酶報(bào)告載體進(jìn)行共轉(zhuǎn)染中,證實(shí)miR-149、miR-18b可直接調(diào)控HLA-CW6基因。最后,將miR-149、miR-18b在HacaT細(xì)胞中轉(zhuǎn)染后,兩者對HaCaT細(xì)胞都有抑制效果,其中miR-149的抑制效果更強(qiáng),且隨著作用時(shí)間的增強(qiáng),細(xì)胞抑制率提高,同時(shí)miR-149對細(xì)胞因子TNF-α、IL8、IL22的分泌水平均有一定的抑制作用,而miR-18b則抑制作用較弱,僅對TNF-α抑制作用較明顯。 結(jié)論： 1.通過生物信息學(xué)分析,建立繪制出基因-miRNA網(wǎng)絡(luò)調(diào)控圖,初步預(yù)測miRNAs可能通過調(diào)控易感基因的表達(dá)而調(diào)控銀屑病的發(fā)病及病情進(jìn)展過程。 2.通過雙熒光素酶檢測,得到miR-149、R-18b熒光素酶活性下調(diào)最為顯著,證實(shí)了miRNAs可靶向調(diào)控HLA-CW06,進(jìn)而推測miRNAs可能通過調(diào)控HLA-Cw6來調(diào)控銀屑病發(fā)病、病情進(jìn)展。 3.通過HaCaT細(xì)胞培養(yǎng),miR-149、miR-18b進(jìn)行轉(zhuǎn)染,發(fā)現(xiàn)miR-149可以使人類永生化細(xì)胞產(chǎn)生明顯的細(xì)胞活力抑制,同時(shí)對細(xì)胞因子TNF-α、IL8、IL22的表達(dá)均有一定的抑制作用,證實(shí)了miR-149對銀屑病發(fā)病及病情進(jìn)展的作用機(jī)制可能與細(xì)胞因子有關(guān)。而miR-18b則對細(xì)胞活力抑制較弱,并且對IL8、IL22的分泌水平無明顯下調(diào)作用,其作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。 4.研究結(jié)果顯示某些miRNAs和其易感基因之間存在某種網(wǎng)絡(luò)樣的調(diào)控機(jī)制,因此我們推測銀屑病的miRNAs-易感基因-細(xì)胞因子之間可能存在著一個(gè)大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并通過整個(gè)網(wǎng)絡(luò)對銀屑病的發(fā)病、病情演變形成調(diào)控,為下一步開展對銀屑病基因?qū)用嬷委熖峁┝诵碌乃悸芳熬�索。
【關(guān)鍵詞】：銀屑病 MicroRNAs 易感基因 HLA-Cw6 細(xì)胞因子
【學(xué)位授予單位】：湖南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R758.63
【目錄】：

• ~.略詞表4-5
• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 引言12-16
• 第一部分 尋常型銀屑病差異性表達(dá)miRNAs與易感基因的相關(guān)性研究16-33
• 前言16-17
• 1. 材料17-18
• 1.1 設(shè)備17
• 1.2 預(yù)分析的靶基因17
• 1.3 預(yù)分析的miRNA17-18
• 2. 方法18-21
• 2.1 數(shù)據(jù)庫18
• 2.2 登錄數(shù)據(jù)網(wǎng)站,輸入靶基因,搜索預(yù)測的miRNA。如圖18-19
• 2.3 HLA-CW06的miRNA預(yù)測19-21
• 3. 結(jié)果21-28
• 3.1 易感基因的靶miRNA預(yù)測21-25
• 3.2 通過3.1的數(shù)據(jù)分析,我們獲得了備選miRNA與易感基因的作用關(guān)系圖表25-28
• 4 分析與討論28-33
• 第二部分 體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)重點(diǎn)驗(yàn)證相關(guān)MiRNA與HLA-Cw6的相關(guān)性33-58
• 前言33-34
• 1 材料與方法34-45
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料34-36
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法36-45
• 2 結(jié)果45-54
• 3 分析與討論54-58
• 第三部分 miRNA對細(xì)胞增殖及細(xì)胞因子分泌的影響58-71
• 前言58-59
• 1. 材料59-60
• 2. 方法60-65
• 3. 結(jié)果65-68
• 4 分析與討論68-71
• 結(jié)論71-72
• 致謝72-73
• 參考文獻(xiàn)73-80

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 于世榮;普雄明;;T細(xì)胞活化因子與銀屑病[J];中國麻風(fēng)皮膚病雜志;2008年03期

2 趙奎;龐全海;;MicroRNA研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通報(bào);2010年12期

，

本文編號：761798