本文關鍵詞：血根堿引起的藥物—藥物相互作用及抗惡性黑素瘤轉移的研究

  更多相關文章： 血根堿 藥物-藥物相互作用 侵襲 轉移 三維培養(yǎng)

【摘要】：背景：血根堿是一種具有抗微生物、抗炎等多種生物學活性的生物堿，因其對多種人類腫瘤細胞系有較強的抑制作用而被推薦為抗癌候選藥物。鑒于對中藥單體的毒性和藥效活性評價是其成藥的兩大前提因素，因此本研究擬對血根堿的毒性和抗癌活性進行深入的探討。藥物的毒副作用已經(jīng)被大量文獻報道，其產(chǎn)生毒性存在種屬差異。血根堿對細胞色素P450酶的抑制與其毒性相關。惡性黑素瘤是高度惡性皮膚腫瘤，可發(fā)生早期血行轉移，腦和肺等是其主要侵襲、轉移器官，該類疾病手術治療困難，且預后極差。惡性黑素瘤惡性程度高、轉移發(fā)生早。理想的抗惡性黑素瘤的藥物最好既能有效的抑制原發(fā)腫瘤的增殖，又能抑制其轉移。目前用于抗腫瘤藥物篩選的體外模型主要是平面培養(yǎng)，即二維模型。細胞二維培養(yǎng)模型存在一些缺陷：缺乏真實的腫瘤組織的微環(huán)境，缺少細胞外基質的支持，腫瘤細胞的貼壁生長使其喪失了某些生物學特性。 目的： 1.研究血根堿是否會誘發(fā)經(jīng)CYP酶抑制的藥物-藥物相互作用。 2.研究血根堿是否能夠抑制人惡性黑色素瘤細胞株451LU的粘附、侵襲、轉移能力。 3.建立一種人惡性黑色素瘤細胞株451LU的三維培養(yǎng)模型，對其形態(tài)學及功能學進行初步評價，并在此基礎上對血根堿的抗腫瘤活性再次進行評價。 方法： 1.通過CYP探針底物反應，對血根堿對CYP酶各個亞型的抑制能力進行評價，繼而通過單點失活實驗、抑制動力學實驗進行可逆和基于時間依賴的抑制動力學參數(shù)測定，根據(jù)FDA推薦的預測公式推導出體內(nèi)血根堿藥物-藥物相互作用程度的預測。 2.用SRB法檢測不同濃度血根堿對惡性黑素瘤細胞細胞活力的影響，通過Annexin-V/PI雙染流式細胞術檢測目標濃度血根堿對惡性黑色素瘤細胞細胞活力的影響。通過transwell腫瘤細胞侵襲實驗、細胞傷口愈合實驗、基質-細胞粘附實驗、內(nèi)皮細胞增殖實驗來檢測血根堿對惡性黑色素瘤細胞侵襲、轉移、粘附及對內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用。通過real time PCR，Western blot來檢測腫瘤轉移、粘附、血管生成相關基因和蛋白的影響。Western Blot法檢測血根堿對惡性黑素瘤細胞的FAK信號通路的影響。 3.將人惡性黑色素瘤細胞株451LU種植于鼠尾膠原中，使細胞在三維立體條件下生長。通過組織學染色、細胞活性分析及免疫熒光染色對細胞的形態(tài)學進行評價，通過DNA含量的測定來反映不同培養(yǎng)條件下細胞增殖的情況，通過real time PCR檢測相關基因表達量的差異。通過MTT法評價四種抗癌藥物對惡性黑素瘤細胞的細胞活力的影響。 結果： 1.對血根堿是否會引經(jīng)CYP酶抑制的藥物-藥物相互作用進行研究首先考察80μM血根堿對CYP各個亞型催化的探針反應的抑制作用，結果顯示對于CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4,血根堿對其活性的抑制超過50%，進一步對其抑制的半數(shù)抑制濃度(IC50)進行測定。血根堿對其催化的反應產(chǎn)生濃度依賴型的抑制，IC50值分別為4.5、10.2、7.2和3.4μM。選擇不同血根堿濃度和探針底物濃度對抑制CYP1A2，CYP2C8，CYP2C9，CYP34的可逆抑制類型和抑制動力學參數(shù)進行了測定。用Lineweaver-Burk作圖方法來判斷可逆抑制類型，用二次作圖來計算抑制動力學參數(shù)。結果表明，血根堿對CYP1A2, CYP3A4和CYP2C9的抑制類型屬于競爭性抑制，而對CYP2C8屬于非競爭性抑制。用Lineweaver-Burk作圖中的每條線的斜率對血根堿濃度作圖，求得可逆抑制常數(shù)Ki，CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4Ki值分別為2.7、8.9、3.8和2.0μM。在單點失活實驗中，加入NADPH預孵后的血根堿對CYP1A2、CYP3A4活性的抑制百分比分別增加了25.5%和20.3%，對其它CYP亞型的抑制增加的百分比均小于15%。研究發(fā)現(xiàn)，血根堿對CYP1A2，CYP3A4催化的反應體現(xiàn)出時間依賴和NADPH依賴的抑制行為。其對兩酶的TDI抑制動力學參數(shù)KI/kinactvalues分別為13.3/0.087和5.58/0.029min-1μM-1. 2.研究血根堿是否能夠抑制人惡性黑色素瘤細胞株451LU的粘附、侵襲、轉移能力0.02-50μM血根堿可以顯著抑制人惡性黑素瘤451-LU細胞的細胞活力，為避免細胞活力因素對后續(xù)實驗的影響，分別選擇安全濃度、低毒濃度和80%細胞活力的三個濃度，即1μM、1.5μM、2μM三個濃度用于后續(xù)實驗。Annexin V和PI雙染流式細胞術可見1-2μM血根堿對451-LU細胞活力無明顯的影響。1-2μM血根堿對451-LU細胞粘附能力均有一定的抑制作用�？梢砸种�451-LU細胞與基質膠原的粘附作用，且抑制能力呈時間、濃度依賴性。血根堿可以抑制451-LU細胞侵襲、遷移的能力，但各組間未見顯著差異。通過SRB方法檢測血根堿對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用，結果顯示，nM級別的血根堿可對人臍靜脈內(nèi)皮細胞出現(xiàn)較強的抑制作用。分別選取與腫瘤轉移相關的三組蛋白，MMP-2、MMP-2、ICAM-1、VCAM-1、EGF和VEGF-A，將原位惡性黑素瘤WM35與轉移株451LU細胞中各蛋白mRNA的表達情況通過realtime-PCR的手段進行檢測，結果顯示ICAM-1、MMP-2、EGF和VEGF-A的mRNA表達存在顯著的增加。1-2μM血根堿均可以抑制ICAM-1，MMP-2, EGF和VEGF-A的mRNA表達。血根堿同樣可以抑制ICAM-1，MMP-2蛋白的表達，可以下調(diào)FAK及P-FAK的表達。 3.人惡性黑素瘤細胞株451LU三維培養(yǎng)模型傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)中，3天左右細胞出現(xiàn)增殖，5天左右開始出現(xiàn)凋亡，到第7天已經(jīng)大部分凋亡，而三維培養(yǎng)條件下，451LU細胞呈腫瘤團狀增殖，至14天仍可見良好細胞活性。與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)條件下的細胞增殖能力顯著增加。顯微鏡下可見細胞呈球團狀生長，晚期(14天)腫瘤團中央可出現(xiàn)缺氧壞死，與在體腫瘤類似。使用MTT的方法對二維培養(yǎng)條件和三維培養(yǎng)條件下阿霉素、長春堿、紫杉醇和血根堿的抗451LU活性進行檢測，在三維培養(yǎng)條件下，阿霉素、長春堿和血根堿各組的IC50值存在不同程度的提升，而紫杉醇組仍舊未檢測到抗癌活性。在三維培養(yǎng)條件下，分別選取在二維培養(yǎng)條件下出現(xiàn)顯著差異的ICAM-1、MMP-2、EGF和VEGF-A，及其在惡性黑素瘤中存在高表達的WT1、BRAF-V600E，與藥物吸收相關的P-gp，與腫瘤細胞脫落相關的KLK7，研究結果發(fā)現(xiàn)，在三維培養(yǎng)條件下，MMP2、ICAM-1、BRAF-V600E、p-gp的mRNA表達出現(xiàn)顯著的增加。 結論： 1.血根堿對CYP1A2、 CYP3A4和CYP2C9產(chǎn)生了競爭性的可逆抑制作用，，對CYP2C8產(chǎn)生了非競爭性的可逆抑制作用。血根堿還對CYP1A2和CYP3A4產(chǎn)生了時間依賴性的抑制。血根堿與CYP1A2、CYP3A4、CYP2C8和CYP2C9的底物共用時可能誘發(fā)嚴重藥物-藥物相互作用。 2.血根堿可以顯著抑制人惡性黑素瘤451LU細胞增殖能力。同時，血根堿可抑制黑素瘤的侵襲轉移及血管生成的能力，其抑制侵襲轉移的能力可能與下調(diào)MMP2、ICAM1、VEGF、EGF的基因、蛋白表達水平相關，血根堿可以下調(diào)FAK及磷酸化FAK的表達。 3.黑素瘤451LU細胞在三維培養(yǎng)模式下生長形態(tài)發(fā)生改變，三維培養(yǎng)的451LU細胞增殖能力較二維顯著提高，三維培養(yǎng)的451LU細胞對藥物敏感程度下降，三維培養(yǎng)條件下MMP2、ICAM1、p-gp、BRAF-V600E的基因表達水平升高。
【關鍵詞】：血根堿 藥物-藥物相互作用 侵襲 轉移 三維培養(yǎng)
【學位授予單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 摘要10-14
• Abstract14-19
• 第一部分 血根堿對人肝細胞色素 P450 酶的抑制研究19-37
• (一) 前言19-21
• (二) 材料和方法21-23
• 1.試劑21
• 2.實驗儀器21
• 3. HLMs 的孵育體系21-22
• 4. 血根堿對各個亞型 CYP 酶的可逆抑制22
• 5. 血根堿對各個亞型 CYP 酶基于時間依賴的抑制22-23
• 6. 血漿游離分數(shù)的測定23
• 7. 基于體外數(shù)據(jù)預測體內(nèi)抑制程度23
• (三) 結果23-26
• 1. 血根堿對各個亞型 CYP 酶的可逆抑制制23-24
• 2. 血根堿對各個亞型 CYP 酶基于時間依賴的抑制24-25
• 3. 體內(nèi)DDI預測25-26
• (四) 討論26-31
• (五）結論31-32
• (六）參考文獻32-37
• 第二部分 血根堿對人惡性黑素瘤 451LU 細胞侵襲、轉移能力的影響37-64
• （一）前言37-38
• （二）材料和方法38-45
• 1. 材料38-39
• 1.1 主要試劑38
• 1.2 主要儀器設備38-39
• 1.3 細胞系39
• 2. 實驗方法39-45
• 2.1 451LU、WM35、ECV304 細胞復蘇39
• 2.2 451LU、WM35、ECV304 細胞傳代39-40
• 2.3 細胞活力測定40
• 2.4 流式細胞術檢測血根堿對451LU細胞活力的影響40-41
• 2.5 細胞劃痕實驗41
• 2.6 基質-細胞粘附實驗41
• 2.7 Transwell 腫瘤侵襲實驗41
• 2.8 血根堿對內(nèi)皮細胞增殖能力的影響41-42
• 2.9 相關基因 mRNA 的表達42-43
• 2.9.1 細胞總RNA的提取42
• 2.9.2 聚合酶鏈反應技術體外擴增 DNA42
• 2.9.3 realtime PCR 檢測相關基因的表達42-43
• 2.10 免疫細胞化學43
• 2.11 Western blot 檢測 MMP、ICAM-1、FAK、p-FAK 蛋白水平43-45
• 2.11.1 蛋白樣品的制備43-44
• 2.11.2 蛋白樣品的定量44
• 2.11.3 SDS-PAGE 電泳44
• 2.11.4 轉膜44-45
• 2.11.5 抗體孵育45
• 2.11.6 蛋白質的化學發(fā)光檢測45
• 2.12 統(tǒng)計學分析45
• （三）結果45-53
• 1.SRB法檢測血根堿對451LU細胞細胞活力的影響45-46
• 2.流式細胞術檢測血根堿對451LU細胞活力的影響46-47
• 3.血根堿對451LU細胞粘附能力的影響47-48
• 4.血根堿對451LU細胞遷移能力的影響48-49
• 5.血根堿對451LU細胞侵襲能力的影響49-50
• 6.血根堿對內(nèi)皮細胞增殖能力的影響50-51
• 7.WM35及451LU細胞相關基因表達差異51
• 8.血根堿對 451LU 細胞 MMP2、ICAM-1mRNA 及蛋白表達的影響51-52
• 9.血根堿對 451LU 細胞 FAK、p-FAK 蛋白表達的影響52-53
• （四）討論53-57
• （五）總結57-58
• （六）參考文獻58-64
• 第三部分 451LU 細胞三維培養(yǎng)模型的構建及評價64-83
• （一）前言64
• （二）材料和方法64-69
• 1. 主要試劑及儀器64-65
• 1.1 主要試劑64
• 1.2 主要儀器設備64-65
• 1.3 細胞系65
• 2. 實驗方法65-69
• 2.1 451LU 細胞復蘇65
• 2.2 451LU 細胞傳代65-66
• 2.3 鼠尾膠原的制備66
• 2.4 451LU 細胞三維模型的構建66
• 2.5 細胞形態(tài)學觀察66
• 2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察66
• 2.7 生長曲線測定66-68
• 2.7.1 總 DNA 的提取66-67
• 2.7.2 DNA 定量67-68
• 2.8 總 RNA 的抽提68
• 2.9 PCR 技術體外擴增 DNA68
• 2.10 相關基因 mRNA 的檢測68-69
• 2.11 統(tǒng)計學分析69
• （三）結果69-74
• 1.二維與三維培養(yǎng)條件，451LU 細胞形態(tài)的變化69-70
• 2.二維與三維培養(yǎng)條件，451LU 細胞生長曲線的變化70
• 3.共聚焦顯微鏡觀察三維培養(yǎng)條件下 451LU 細胞細胞活力的變化70-71
• 4.阿霉素、長春堿、紫杉醇、血根堿對二維與三維培養(yǎng)條件下 451LU細胞細胞活力的影響71-73
• 5.二維與三維培養(yǎng)條件下， 451LU 細胞相關基因的表達差異73-74
• （四）討論74-78
• （五）總結78-79
• （六）參考文獻79-83
• 綜述83-100
• 參考文獻90-100
• 發(fā)表文章、參與課題及科研獲獎100-102
• 致謝102-103

【共引文獻】

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本文編號：760733