本文關(guān)鍵詞：MicroRNA-125b抑制惡性黑色素瘤細胞的生長及相關(guān)信號通路的研究

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【摘要】：背景:黑色素瘤是一種侵襲性極強的惡性腫瘤,在過去30年它是所有類型癌癥中發(fā)病率增長最快的惡性腫瘤之一。雖然經(jīng)歷了幾十年的研究和藥物開發(fā),但其治療效果仍不理想,該腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機制也尚未完全闡明。目前已知miRNA是一類非編碼小分子RNAs,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達,參與生物復(fù)雜生命過程的調(diào)控,尤其是腫瘤的發(fā)生和進展。因此,嘗試通過對黑色素瘤miRNA及其靶基因和相關(guān)信號通路的研究,為黑色素瘤的早期診斷和治療提供新依據(jù)。目的:預(yù)實驗已經(jīng)證實miR-125b在黑色素瘤中低表達,靶基因是MLK3。本實驗通過構(gòu)建miR-125b過表達穩(wěn)轉(zhuǎn)黑色素瘤細胞系,觀察過表達miR-125b對細胞增殖、凋亡和周期的影響,確定miR-125b在黑色素瘤中的抑癌作用,并進一步探索與miR-125b發(fā)揮抑瘤作用相關(guān)的可能信號通路。闡明miR-125b在黑色素瘤中發(fā)揮抑癌基因作用的分子機制,為后期臨床治療提供依據(jù)。方法:構(gòu)建microRNA-125b過表達慢病毒,轉(zhuǎn)染原發(fā)性黑色素瘤細胞A375和侵襲性黑色素瘤胞SK-MEL-5,得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株。轉(zhuǎn)染目的病毒的為實驗組A375-125b up、SK-125b up,轉(zhuǎn)染空載病毒的為陰性對照組A375-negative、SK-negative,未轉(zhuǎn)染病毒的為空白組A375、SK-MEL-5。采用RT-PCR法檢測各組細胞miR-125b的表達水平,MTT法檢測細胞的增殖情況,流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡和細胞周期。Western Blot檢測靶蛋白MLK3的表達水平,及各通路上關(guān)鍵蛋白(p-C-jun、C-jun、ERK1/2、MEK2、p-AKT、AKT1)的表達水平。結(jié)果:1.RT-PCR結(jié)果顯示:miR-125b在實驗組細胞中的表達量較空白組、陰性對照組的表達量明顯增多(P0.05),證實miR-125b在轉(zhuǎn)染細胞中有效過表達;而陰性對照組細胞中miR-125b的表達量與空白組無明顯差異(P0.05)。2.MTT結(jié)果顯示:A375-125bup細胞與A375-negative細胞、空白組細胞相比增殖活性明顯降低(P0.05),而A375-negative細胞較空白組細胞增殖活性無明顯差異(P0.05);SK-MEL-5細胞與A375細胞的變化趨勢相同。3.流式檢測結(jié)果:A375-125bup細胞與A375-negative細胞相比早期凋亡率明顯增高(P0.05),G0/G1期的細胞比例明顯增多而S期細胞比例減少(P0.05);SK-125bup細胞與SK-negative細胞相比也有同樣趨勢的變化,均有統(tǒng)計學(xué)差異。4.Western Blot結(jié)果顯示:MLK3在A375-125bup細胞中的表達低于A375-negative細胞中的表達(P0.05),p-C-jun、C-jun、ERK1/2、MEK2、p-AKT、AKT1在A375-125bup細胞中的表達量較于陰性對照組細胞均下降(P0.05);SK-MEL-5細胞各蛋白的變化趨勢與A375細胞相同,證實過表達的miR-125b抑制靶基因MLK3的表達,并可能通過阻滯C-jun、ERK、AKT通路發(fā)揮抑瘤作用。結(jié)論:1.成功構(gòu)建miR-125b過表達慢病毒載體,穩(wěn)轉(zhuǎn)成功的黑色素瘤細胞細胞內(nèi)miR-125b的表達上調(diào)。2.MiR-125b表達上調(diào)能抑制細胞增殖,促進細胞凋亡,細胞周期阻滯在G0/G1期,發(fā)揮抑瘤作用。3.MiR-125b的靶點為MLK3蛋白,而且對C-jun通路、ERK通路以及AKT通路均有影響。4.MiR-125b有望成為治療人惡性黑色素瘤有效靶點。
【關(guān)鍵詞】：惡性黑色素瘤 miR-125b MLK3 慢病毒 增殖 凋亡
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 摘要3-5
• ABSTRACT5-10
• 中英文縮略詞表10-11
• 第1章 引言11-15
• 第2章 材料與方法15-31
• 2.1 材料15-19
• 2.1.1 實驗細胞15
• 2.1.2 主要試劑15-16
• 2.1.3 儀器設(shè)備16-17
• 2.1.4 實驗試劑的配置17-19
• 2.2 實驗方法19-30
• 2.2.1 細胞培養(yǎng)相關(guān)實驗19-21
• 2.2.2 慢病毒過表達載體感染A375細胞21-22
• 2.2.3 實驗分組22-23
• 2.2.4 RT-PCR方法檢測各組細胞中miRNA-125b的表達23-25
• 2.2.5 生物功能學(xué)檢測25-27
• 2.2.6 Western blot技術(shù)檢測各組細胞中蛋白的表達27-30
• 2.3 統(tǒng)計學(xué)處理30-31
• 第3章 結(jié)果31-38
• 3.1 各組細胞的鏡下形態(tài)31-32
• 3.2 RT-PCR方法檢測各組細胞中miRNA-125b的表達32-33
• 3.2.1 RNA完整性32
• 3.2.2 MiRNA-125b表達32-33
• 3.3 生物功能學(xué)檢測結(jié)果33-37
• 3.3.1 細胞的增殖功能檢測33-34
• 3.3.2 細胞的凋亡功能檢測34-36
• 3.3.3 細胞的周期功能檢測36-37
• 3.4 轉(zhuǎn)染慢病毒后各關(guān)鍵蛋白在細胞中的表達結(jié)果37-38
• 第4章 討論38-42
• 第5章 結(jié)論42-43
• 致謝43-44
• 參考文獻44-47
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果47-48
• 綜述 MicroRNA在黑色素瘤中的研究進展48-58
• 參考文獻55-58

【參考文獻】

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本文編號：724901