本文關(guān)鍵詞：毛乳頭細(xì)胞凝膠球的構(gòu)建及其毛囊誘導(dǎo)的初步研究

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【摘要】：組織工程皮膚在頑固性潰瘍及小面積創(chuàng)面方面都取得了較好的療效,但遺憾的是由于缺乏皮膚附屬器,使得組織工程皮膚同正常皮膚在形態(tài)、功能、質(zhì)地等方面仍然有一定差距。毛囊是皮膚重要的附屬器,不僅具有美容作用,還參與皮膚的生理代謝、防御、自我更新等。毛乳頭位于毛囊底部,對(duì)毛囊的形成、發(fā)生發(fā)育、生長周期調(diào)控等方面均有至關(guān)重要的作用,并且研究表明毛乳頭細(xì)胞的毛囊誘導(dǎo)能力與其凝集性生長特性密切相關(guān)。毛囊的體內(nèi)誘導(dǎo)試驗(yàn)較易成功,但其體外誘導(dǎo)卻未取得突破,其中最重要的原因是毛囊形成不僅需要上皮和間質(zhì)細(xì)胞的相互作用,同時(shí)還需要一個(gè)適宜的微環(huán)境。在體內(nèi),血液的流動(dòng)為毛囊的發(fā)育提供了一個(gè)由信號(hào)分子、激素和細(xì)胞外基質(zhì)等組成并相互作用的微環(huán)境,這種復(fù)雜的微環(huán)境很難在體外模擬。隨著灌注培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用,體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的營養(yǎng)供應(yīng)、機(jī)械力作用、分子滲透等可以在一定程度上被模擬。本研究中,擬分離培養(yǎng)大鼠觸須部毛乳頭,建立了毛乳頭細(xì)胞凝膠球的三維培養(yǎng)方,并利用灌注培養(yǎng)裝置進(jìn)行含毛乳頭細(xì)胞凝膠球的組織工程皮膚的灌注培養(yǎng),對(duì)毛囊的體外誘導(dǎo)進(jìn)行初步探索。目的:1.分析對(duì)比顯微解剖膠原酶聯(lián)合分離法與兩步酶消化法分離培養(yǎng)大鼠觸須部毛乳頭的效果,從而建立高效、快捷、簡(jiǎn)便分離大鼠觸須部毛乳頭的方法。2.創(chuàng)建膠原凝膠法以構(gòu)建富含細(xì)胞外基質(zhì)的三維毛乳頭細(xì)胞凝膠球,探討適宜的體外毛乳頭重建方式,并恢復(fù)高代毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長特性。3.制備含有毛乳頭細(xì)胞凝膠球的雙層組織工程皮膚,在灌注式生物反應(yīng)器中進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng),觀察體外毛囊誘導(dǎo)情況。方法:1.采用顯微解剖膠原酶聯(lián)合分離法與兩步酶消化法,分別進(jìn)行SD大鼠觸須部毛乳頭的分離及傳代培養(yǎng),觀察比較毛乳頭收獲率、形態(tài)、類型、貼壁時(shí)間、操作效率等,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析;2.選用鼠尾膠原制成的膠原凝膠為支架材料,采用不同凝膠量及不同細(xì)胞量組合構(gòu)建三維毛乳頭細(xì)胞凝膠球,探討適宜的體外重建毛乳頭的方式,觀察不同組合成球的時(shí)間、大小、形態(tài);3.分別采用1代及6代毛乳頭細(xì)胞構(gòu)建凝膠球,比較其活力,通過α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、多能蛋白聚糖(versican)免疫熒光染色檢測(cè)毛乳頭細(xì)胞凝膠球的凝集性及毛囊誘導(dǎo)力;4.運(yùn)用兩步酶消化法分離培養(yǎng)人的角質(zhì)形成細(xì)胞(keratinocyte,KC)、成纖維細(xì)胞(fibroblast,Fb)并傳代培養(yǎng),制備含有毛乳頭細(xì)胞凝膠球的組織工程雙層皮膚,在灌注式生物反應(yīng)器中進(jìn)行動(dòng)態(tài)培養(yǎng),并與靜態(tài)對(duì)比,10天后取材進(jìn)行HE染色,對(duì)比觀察組織結(jié)構(gòu)變化情況。結(jié)果:1.顯微解剖膠原酶聯(lián)合分離法和兩步酶消化法都能獲得完整毛乳頭,兩步酶消化法操作時(shí)間短,獲得的毛乳頭數(shù)量多,包括觸須型和觸須部被毛毛乳頭;而顯微解剖膠原酶聯(lián)合分離法獲得的毛乳頭數(shù)量較少,純度較高;但兩種方法獲得的毛乳頭在貼壁時(shí)間、細(xì)胞遷出時(shí)間上無顯著性差異;2.創(chuàng)建的膠原凝膠法能成功構(gòu)建三維毛乳頭細(xì)胞凝膠球;3.獲得的凝膠球形態(tài)均為圓形或橢圓形,直徑在200-1250μm大小不等;細(xì)胞數(shù)與凝膠量的多少,均能對(duì)成球直徑產(chǎn)生影響,且有交互作用;在探索的實(shí)驗(yàn)條件中,100μl凝膠+105個(gè)細(xì)胞情況下得到的成球直徑預(yù)測(cè)值最小,為352μm;隨著細(xì)胞量的減少、凝膠量的增多,凝膠球直徑有逐漸增大的趨勢(shì)。4.將1代及6代毛乳頭細(xì)胞構(gòu)成的凝膠球移出到新的培養(yǎng)板后可觀察到1代毛乳頭細(xì)胞凝膠球周邊可見完整毛乳頭細(xì)胞凝集性生長的細(xì)胞團(tuán),而6代DPCs凝膠球可見單個(gè)毛乳頭細(xì)胞呈放射狀遷出;5.1代和6代毛乳頭細(xì)胞凝膠球α-SMA、versican免疫熒光檢測(cè)均為陽性;而二維培養(yǎng)的6代毛乳頭細(xì)胞α-SMA、versican免疫熒光檢測(cè)為陰性;6.灌注式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)的組織工程皮膚,10天后取材行HE染色顯示,表皮真皮結(jié)構(gòu)較靜態(tài)培養(yǎng)的層次更為清晰,表皮層未見角化過度或脫落;7.相比于靜態(tài)培養(yǎng),在灌注培養(yǎng)中,毛乳頭細(xì)胞凝膠球與人Fb、KC構(gòu)建的組織工程皮膚契合更佳;并且在凝膠球上方可見表皮下陷,形成類似“毛芽”樣結(jié)構(gòu)。結(jié)論：兩步酶消化法是一種方便、快捷、高效率的分離大鼠觸須部毛乳頭的方法;膠原凝膠法是體外重建毛乳頭的有效方法,并且能夠使高代的毛乳頭細(xì)胞部分恢復(fù)凝集性生長特性及毛囊誘導(dǎo)能力;灌注式生物反應(yīng)器較靜態(tài)培養(yǎng)更適合于組織工程皮膚的培養(yǎng),含有毛乳頭細(xì)胞凝膠球的組織工程皮膚在灌注培養(yǎng)條件下有體外誘導(dǎo)形成毛囊的潛能。
【關(guān)鍵詞】：毛乳頭 凝集性 膠原凝膠 灌注式培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R751
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-11
• 第一章 前言11-12
• 第二章 SD大鼠觸須部毛乳頭的分離、培養(yǎng)12-19
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料12-14
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法14-15
• 2.3 結(jié)果15-18
• 2.4 討論18-19
• 第三章 毛乳頭細(xì)胞三維凝膠球的構(gòu)建19-30
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料19-20
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法20-23
• 3.3 結(jié)果23-27
• 3.4 討論27-30
• 第四章 灌注式生物反應(yīng)器中含毛乳頭細(xì)胞凝膠球的組織工程皮膚的培養(yǎng)30-41
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料31-32
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法32-34
• 4.3 結(jié)果34-38
• 4.4 討論38-41
• 全文總結(jié)41-42
• 參考文獻(xiàn)42-47
• 文獻(xiàn)綜述 維持毛乳頭細(xì)胞凝集性的研究進(jìn)展47-53
• 參考文獻(xiàn)50-53
• 攻讀碩士期間發(fā)表的文章53-54
• 致謝54

【引證文獻(xiàn)】

中國重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 鄭敏;呂中法;吳賢杰;;培養(yǎng)毛乳頭細(xì)胞生物學(xué)特性和毛囊重建的研究[A];2006年浙江省整形外科與醫(yī)學(xué)美容學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

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本文編號(hào)：710432