本文關(guān)鍵詞：調(diào)節(jié)性B細(xì)胞與自身免疫性皰病的相關(guān)性研究

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【摘要】：自身免疫性皰�。╝utoimmune bullous diseases, AIBDs）是一組臨床表現(xiàn)為紅斑、糜爛、水皰、大皰的自身免疫性疾病，病情多頑固且易反復(fù)發(fā)作[1,2]。目前認(rèn)為該類(lèi)疾病的發(fā)病主要是由致病性抗體與抗原結(jié)合并激活一系列的免疫炎癥反應(yīng)導(dǎo)致表皮間或者真皮基底膜帶的不同粘附分子被破壞而致病。大皰性類(lèi)天皰瘡（bullouspemphigoid，BP）和尋常型天皰瘡（pemphigus vulgaris，PV）是最為常見(jiàn)的靶抗原明確的自身免疫性皰病[3-5]。PV中自身反應(yīng)性B細(xì)胞和CD4~+T細(xì)胞識(shí)別的主要靶抗原為橋粒芯糖蛋白1（Dsg1）和橋粒芯糖蛋白3（Dsg3），BP中主要靶抗原為大皰性類(lèi)天皰瘡抗原1和抗原2，即BPAG1（BP230）和BPAG2（BP180），目前認(rèn)為BP180是BP主要的致病性抗原，其胞外端的第16位非膠原編碼區(qū)（NC16A）區(qū)域是主要的致病性靶表位區(qū)[6-9]。 近年來(lái)的研究證實(shí)致病性自身抗體的產(chǎn)生是自身免疫性皰病的關(guān)鍵致病因素[10]。但是自身抗體是如何產(chǎn)生的，以及免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞如調(diào)節(jié)性B細(xì)胞(regulatory Bcells, Breg)、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Treg)以及體液免疫中輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體的濾泡輔助性T細(xì)胞（follicular helper T cells，，Tfh）在自身免疫性皰病發(fā)病中的作用目前均不清楚。 B細(xì)胞是否像T細(xì)胞一樣存在多種不同調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞亞群是目前免疫學(xué)研究的熱點(diǎn)，并于近年取得了很多重要的研究發(fā)現(xiàn)。目前已經(jīng)明確并得到公認(rèn)在小鼠體內(nèi)存在一群主要通過(guò)分泌白介素10(IL-10)而發(fā)揮負(fù)向免疫調(diào)節(jié)作用的為數(shù)較少的Breg亞群，其表面標(biāo)記為CD19~+CD5~+CD1dhi，并且在多種疾病包括I型糖尿病、接觸性超敏反應(yīng)、膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎等動(dòng)物模型中證實(shí)了其對(duì)免疫炎癥反應(yīng)的抑制作用[11-13]。2011年美國(guó)杜克大學(xué)的一個(gè)研究小組證實(shí)了類(lèi)似小鼠調(diào)節(jié)性B細(xì)胞的人調(diào)節(jié)性B細(xì)胞亞群的存在，其主要的表面標(biāo)記為CD19~+CD24~(hi)CD27~+,并發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞亞群與多種自身免疫性疾病有著密切的聯(lián)系[14]。Breg細(xì)胞與自身免疫性皰病的關(guān)系如何？Breg細(xì)胞對(duì)致病性自身抗體的產(chǎn)生有什么樣的影響？本課題通過(guò)檢測(cè)尋常型天皰瘡和大皰性類(lèi)天皰瘡患者外周血中Breg細(xì)胞水平，研究Breg細(xì)胞與AIBDs發(fā)病的相關(guān)性，通過(guò)觀(guān)察Breg細(xì)胞對(duì)大皰性類(lèi)天皰瘡抗體產(chǎn)生的影響，初步探討B(tài)reg細(xì)胞參與AIBDs發(fā)病過(guò)程中抗體產(chǎn)生的機(jī)制，從而深化對(duì)AIBDs發(fā)病機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為其治療提供新的思路。 目的：明確Breg細(xì)胞與PV和BP兩種疾病的相關(guān)性，確定BP患者外周血Breg細(xì)胞的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能，觀(guān)察Breg細(xì)胞對(duì)大皰性類(lèi)天皰瘡致病性自身抗體產(chǎn)生的影響，探討其在A(yíng)IBDs發(fā)病中的重要作用。 方法： 1)收集PV和BP患者及健康對(duì)照者外周血，分離提取獲得相應(yīng)的血清、PBMC以及RNA； 2)利用流式細(xì)胞術(shù)觀(guān)察患者PBMC中Breg細(xì)胞水平的變化； 3)利用Realtime-PCR和Elisa方法分析患者及健康對(duì)照者的外周血中IL-10的表達(dá)水平； 4)利用磁珠分選及流式細(xì)胞術(shù)分選健康人以及BP患者外周血的Breg細(xì)胞（CD19~+CD24~(hi)CD27~+）和效應(yīng)T細(xì)胞（CD4~+CD25-）；通過(guò)構(gòu)建細(xì)胞共孵育模型，研究Breg細(xì)胞對(duì)效應(yīng)T細(xì)胞的負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能； 5)原核表達(dá)BP自身抗原BP180-NC16A，以該抗原刺激BP患者PBMC，通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)上清中致病性抗體水平的變化，比較Breg細(xì)胞是否影響致病性抗體的產(chǎn)生。 結(jié)果：自身免疫性皰病PV、BP患者外周血中Breg細(xì)胞水平明顯高于健康對(duì)照組。患者外周血中IL-10在蛋白水平及RNA水平與健康對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異。健康人外周血中Breg細(xì)胞能夠明顯抑制CD4~+T細(xì)胞IFN-γ、TNF-α以及IL-4的產(chǎn)生和CD4~+T細(xì)胞的增殖，而來(lái)自BP患者的Breg細(xì)胞對(duì)CD4~+T細(xì)胞IFN-γ、TNF-α、IL-4的產(chǎn)生以及CD4~+T細(xì)胞增殖的抑制作用存在缺陷。來(lái)自BP患者的B細(xì)胞對(duì)BP180-NC16A抗原具有抗原特異性反應(yīng)，其分泌的致病性抗體水平明顯升高；而清除Breg細(xì)胞亞群（CD19~+CD24~(hi)CD27~+）后進(jìn)行BP180-NC16A抗原刺激培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)在無(wú)Breg細(xì)胞情況下抗體產(chǎn)生水平未受明顯影響。 結(jié)論：BP和PV患者外周血中Breg細(xì)胞數(shù)量增多，提示Breg細(xì)胞可能與自身免疫性皰病的發(fā)病有相關(guān)性。BP患者Breg細(xì)胞負(fù)向免疫調(diào)節(jié)功能存在缺陷，而且Breg細(xì)胞不能有效抑制輔助性T細(xì)胞和產(chǎn)生抗BP180NC16A抗體的B細(xì)胞的活性，這可能是這類(lèi)疾病致病性自身抗體產(chǎn)生的重要機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Breg） 白介素-10（IL-10） 自身免疫 皰病 自身抗體
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R758.66
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表6-8
• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-15
• 文獻(xiàn)回顧15-31
• 一、自身免疫性皰病15-24
• 1 大皰性類(lèi)天皰瘡15-21
• 1.1 大皰性類(lèi)天皰瘡歷史回顧15-16
• 1.2 大皰性類(lèi)天皰瘡自身抗原16-17
• 1.3 大皰性類(lèi)天皰瘡發(fā)病機(jī)制研究現(xiàn)狀17-21
• 2 尋常型天皰瘡21-24
• 2.1 天皰瘡歷史回顧21-22
• 2.2 尋常型天皰瘡的自身抗原22
• 2.3 尋常型天皰瘡發(fā)病機(jī)制的研究現(xiàn)狀22-24
• 二、免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞與自身免疫性疾病抗體產(chǎn)生機(jī)制的研究進(jìn)展24-27
• 1 自身抗體產(chǎn)生的途徑25
• 2 免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞亞群抑制致病性抗體的產(chǎn)生25-27
• 三、調(diào)節(jié)性 B 細(xì)胞27-31
• 1 調(diào)節(jié)性 B 細(xì)胞的歷史27-28
• 2 調(diào)節(jié)性 B 細(xì)胞分化和功能相關(guān)分子28-29
• 3 調(diào)節(jié)性 B 細(xì)胞的來(lái)源與分化29
• 4 人調(diào)節(jié)性 B 細(xì)胞29-31
• 1 材料31-35
• 1.1 主要儀器設(shè)備31-32
• 1.2 主要試劑32-33
• 1.3 主要試劑配制33-35
• 1.4 研究對(duì)象35
• 2 方法35-44
• 2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分離35
• 2.2 血清的分離與保存35-36
• 2.3 全血 RNA 的提取與保存36
• 2.4 自身免疫性皰病患者 CD19~+IL10~+細(xì)胞水平的檢測(cè)36-37
• 2.5 自身免疫性皰病患者 Breg（CD19~+CD24~(hi)CD27~+）細(xì)胞水平的檢測(cè)37
• 2.6 血清中 IL-10 水平的檢測(cè)37-38
• 2.7 外周血 IL-10 RNA 水平的檢測(cè)38
• 2.8 健康人及 BP 患者外周血 Breg 細(xì)胞對(duì)效應(yīng) T 細(xì)胞增殖的影響38-40
• 2.9 健康人及 BP 患者外周血 Breg 細(xì)胞對(duì)效應(yīng) T 細(xì)胞炎癥因子產(chǎn)生的影響40-41
• 2.10 重組人 BP180NC16A (GST-NC16A)抗原的表達(dá)、純化及其活性檢測(cè)41-43
• 2.11 BP 患者 Breg 細(xì)胞(CD19~+CD24~(hi)CD27~+)對(duì)致病性抗體產(chǎn)生的影響43-44
• 3 結(jié)果44-53
• 3.1 自身免疫性皰病患者外周血 CD19~+IL10~+細(xì)胞數(shù)量增加44-45
• 3.2 自身免疫性皰病患者外周血 Breg (CD19~+CD24~(hi)CD27~+)細(xì)胞的數(shù)量增加45-47
• 3.3 自身免疫性皰病患者外周血 IL-10 水平的變化47-48
• 3.4 BP 患者 Breg 細(xì)胞對(duì)效應(yīng) T 細(xì)胞增殖的抑制作用減弱48-49
• 3.5 BP 患者 Breg 細(xì)胞對(duì)效應(yīng) T 細(xì)胞產(chǎn)生炎癥因子的抑制作用減弱49-51
• 3.6 大皰性類(lèi)天皰瘡患者 Breg 細(xì)胞對(duì)致病性抗體產(chǎn)生的抑制作用喪失51-53
• 4 討論53-55
• 小結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-75
• 附錄75-78
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果78-79
• 致謝79-80

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：570276