本文關(guān)鍵詞：靶向Neuropilin-1單克隆抗體對皮膚癌細(xì)胞生長抑制作用及其機(jī)制的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景和目的 在日照豐富的國家,皮膚癌的患病率極高,其病因復(fù)雜,發(fā)病機(jī)制各異,而傳統(tǒng)的放療、化療手段存在抗腫瘤效果差、副作用大等一系列缺點(diǎn)。分子靶向治療卻有著良好的腫瘤靶向性和較低的毒副作用,為癌癥治療提供了新的治療手段。近期研究顯示神經(jīng)鞭毛素蛋白-1(Neuropilin-1, NRP-1)是癌癥治療的新靶標(biāo),NRP-1是一個新型的多功能受體,是I型跨膜糖蛋白。NRP-1可作為軸突導(dǎo)向因子3(semaphorin3, Sema3)、血管內(nèi)皮細(xì)胞因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor, HGF)等多種細(xì)胞因子的共受體,參與調(diào)控多種細(xì)胞因子介導(dǎo)的經(jīng)典信號通路,同時其本身也具有獨(dú)立的信號通路,與腫瘤血管新生及腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。許多實(shí)驗(yàn)證明NRP-1在皮膚癌上有較高的表達(dá),并與其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),但作用機(jī)制尚不清楚。本文旨在檢測本實(shí)驗(yàn)室制各的抗NRP-1單克隆抗體(NRP-1mAb)對皮膚癌細(xì)胞株生存的影響,并探討其作用機(jī)制,為發(fā)展一種以NRP-1為靶標(biāo)的新型抗腫瘤策略奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法 利用Balb/c鼠生產(chǎn)NRP-1mAb; rProtein A柱純化抗體；SDS-PAGE蛋白電泳檢測抗體的純度和濃度；間接ELISA鑒定抗體活性；流式細(xì)胞術(shù)、Western blotting、細(xì)胞免疫熒光及免疫組化檢測NRP-1mAb的特異性及NRP-1蛋白在皮膚癌細(xì)胞株和皮膚癌組織上的表達(dá)情況；光鏡觀察NRP-1mAb對細(xì)胞形態(tài)的影響；細(xì)胞抑制實(shí)驗(yàn)(MTT)和集落形成抑制試驗(yàn)檢測NRP-1mAb對皮膚癌細(xì)胞株增殖的影響；流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞核熒光染色檢測NRP-1mAb對皮膚癌細(xì)胞株凋亡的影響；Western blotting檢測凋亡相關(guān)蛋白(Caspase-3、Bax、Bcl-2)和增殖相關(guān)蛋白(PI3K、p-Akt、Akt、p-ERK1/2、ERK1/2)的表達(dá),分析NRP-1mAb對PI3K/Akt和MEK/ERK信號通路的激活情況,探討NRP-1mAb對皮膚癌細(xì)胞的作用機(jī)制。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 制備純化的NRP-1mAb純度高達(dá)96.5%,效價約為1×10-6,同時不同批次效價類似,表明其活性穩(wěn)定。NRP-1mAb與NRP-1blb2蛋白、B16F10細(xì)胞和A431細(xì)胞分別在39KDa、100KDa和130KDa處均有特異性的結(jié)合帶。兩株皮膚癌細(xì)胞株及皮膚癌組織上NRP-1抗原表達(dá)呈陽性,主要定位于細(xì)胞膜上,且A431表達(dá)更高；MTT結(jié)果顯示NRP-1mAb能抑制皮膚癌細(xì)胞株A431和B16F10的增殖,且抑制作用與劑量和時間正相關(guān)。細(xì)胞集落形成抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,不同濃度抗體均可顯著抑制細(xì)胞集落的形成,并呈劑量依賴性。細(xì)胞核Hoechst33258熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明NRP-1mAb可誘導(dǎo)皮膚癌細(xì)胞凋亡,并呈劑量依賴性。Western blotting檢測到NRP-1mAb作用皮膚癌細(xì)胞后Bax表達(dá)上調(diào)、Caspase-3的剪切帶增加,Bcl-2、PI3K(85)、p-Akt、p-ERK1/2表達(dá)下調(diào)。 結(jié)論 1.本課題成功制備了高純度、高效價且效價穩(wěn)定的NRP-1mAb。 2.NRP-1mAb能特異性的結(jié)合皮膚癌細(xì)胞上NRP-1蛋白,且皮膚癌細(xì)胞及皮膚癌組織上高表達(dá)NRP-1。 3.NRP-1mAb能顯著抑制皮膚癌細(xì)胞的生長并呈時效、量效關(guān)系。 4.NRP-1mAb對皮膚癌細(xì)胞的生長抑制作用與下調(diào)PI3K/Akt和MEK/ERK信號通路相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：Neuropilin-1 單克隆抗體 皮膚癌 增殖 凋亡
【學(xué)位授予單位】：廈門大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-16
• 前言16-32
• 一、皮膚癌概述16-19
• 1 皮膚癌的發(fā)病原因及發(fā)病機(jī)制16-18
• 1.1 皮膚癌的發(fā)病原因16-17
• 1.2 皮膚癌的發(fā)病機(jī)制17-18
• 2 皮膚癌的治療18-19
• 二、Neuropilin-1概述19-29
• 1 NRP-1的結(jié)構(gòu)及其異構(gòu)體19-21
• 2 NRP-1的表達(dá)21-22
• 3 NRP-1的配體與共受體22-26
• 3.1 Plexin和semaphorin23
• 3.2 VEGF和VEGFR23-24
• 3.3 TGF-p和TGFR24
• 3.4 FGF、HGF和c-Met24
• 3.5 PDGF和PDGFR24-25
• 3.6 EGF和EFGR25
• 3.7 Fibronectin和Integrin25-26
• 4 NRP-1的功能26-29
• 4.1 NRP-1與血管生成26-27
• 4.2 NRP-1與神經(jīng)發(fā)育27-28
• 4.3 NRP-1與腫瘤的發(fā)生發(fā)展28
• 4.4 NRP-1與免疫調(diào)節(jié)28-29
• 5 靶向NRP-1的藥物29
• 三、NRP-1在皮膚癌中研究進(jìn)展29-30
• 四、研究目的和內(nèi)容30-32
• 第一章 NRP-1 mAb的制備、純化及鑒定32-44
• 一、材料和方法32-41
• 1 材料32-37
• 1.1 細(xì)胞株和實(shí)驗(yàn)動物32
• 1.2 主要試劑及耗材32-33
• 1.3 主要儀器及設(shè)備33
• 1.4 主要溶液的配制33-37
• 2 方法37-41
• 2.1 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)37-38
• 2.2 抗體的生產(chǎn)38
• 2.3 抗體的純化38-39
• 2.4 抗體的透析和凍干39
• 2.5 抗體的純度鑒定39-40
• 2.6 抗體的濃度測定40
• 2.7 抗體的滴度鑒定40-41
• 二、結(jié)果與分析41-43
• 1 純度測定41-42
• 2 滴度測定42-43
• 三、討論43-44
• 第二章 NRP-1在皮膚癌細(xì)胞株及皮膚癌組織中的表達(dá)44-54
• 一、材料和方法44-49
• 1 材料44-45
• 1.1 細(xì)胞株44
• 1.2 主要試劑及耗材44
• 1.3 主要儀器及設(shè)備44-45
• 1.4 主要溶液的配制45
• 2 方法45-49
• 2.1 流式細(xì)胞術(shù)45-46
• 2.2 Western blotting46-47
• 2.3 細(xì)胞免疫熒光染色47-48
• 2.4 免疫組織化學(xué)染色48-49
• 二、結(jié)果與分析49-53
• 1 流式細(xì)胞術(shù)49-50
• 2 Western blotting50
• 3 細(xì)胞免疫熒光染色50-51
• 4 免疫組織化學(xué)染色51-53
• 三、討論53-54
• 第三章 NRP-1 mAb對皮膚癌細(xì)胞的生長抑制作用54-67
• 一、材料和方法54-58
• 1 材料54-55
• 1.1 細(xì)胞株54
• 1.2 主要試劑及耗材54
• 1.3 主要儀器及設(shè)備54-55
• 1.4 主要溶液的配制55
• 2 方法55-58
• 2.1 細(xì)胞計數(shù)55-56
• 2.2 細(xì)胞生長抑制試驗(yàn)56
• 2.3 集落形成抑制實(shí)驗(yàn)56-57
• 2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡57
• 2.5 熒光顯微鏡法觀察細(xì)胞凋亡57-58
• 2.6 統(tǒng)計學(xué)處理58
• 二、結(jié)果與分析58-65
• 1 抗NRP-1抗體抑制細(xì)胞增殖58-63
• 1.1 普通顯微鏡法觀察細(xì)胞形態(tài)變化58-60
• 1.2 MTT法60-62
• 1.3 集落形成抑制實(shí)驗(yàn)62-63
• 2 抗NRP-1抗體促進(jìn)細(xì)胞凋亡63-65
• 2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡63-65
• 2.2 熒光顯微鏡法觀察細(xì)胞凋亡65
• 三、討論65-67
• 第四章 NRP-1 mAb對皮膚癌細(xì)胞生長抑制作用機(jī)制67-75
• 一、材料和方法67-68
• 1 材料67-68
• 1.1 細(xì)胞株67
• 1.2 主要試劑及耗材67
• 1.3 主要儀器及設(shè)備67
• 1.4 主要溶液的配制67-68
• 2 方法68
• 二、結(jié)果與分析68-71
• 1 凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、Bax和Bcl-2的表達(dá)68-70
• 2 增殖相關(guān)蛋白PI3K(85)、p-Akt和p-ERK1/2的表達(dá)70-71
• 三、討論71-75
• 結(jié)論75-76
• 本文存在的問題及今后應(yīng)開展的研究76-77
• 參考文獻(xiàn)77-91
• 致謝91-92
• 研究生在學(xué)期間發(fā)表的主要學(xué)術(shù)論文目錄92

【相似文獻(xiàn)】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 呂莎;靶向Neuropilin-1單克隆抗體對皮膚癌細(xì)胞生長抑制作用及其機(jī)制的研究[D];廈門大學(xué);2014年

2 馬紅櫻;荒漠藻胞外聚合物抗腫瘤活性及其機(jī)理研究[D];西北師范大學(xué);2005年

  本文關(guān)鍵詞：靶向Neuropilin-1單克隆抗體對皮膚癌細(xì)胞生長抑制作用及其機(jī)制的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：417850