發(fā)布時間：2017-05-23 21:07

  本文關(guān)鍵詞：人皮膚成纖維細胞光源性提前衰老模型的建立與相關(guān)miRNA篩查分析及miR-34c調(diào)控光老化進程作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：研究背景 光是一把雙刃劍，一方面人們的生活離不開光，，另一方面光又因其生物學(xué)作用不可避免的對人體產(chǎn)生傷害。日光中紫外線可引起日曬紅斑、日曬黑、光老化、光敏性皮膚病甚至發(fā)生癌癥。 衰老是一種不可避免的自然規(guī)律，在皮膚上主要表現(xiàn)為皮膚粗糙、增厚、松弛，自然因素或非自然因素均可導(dǎo)致皮膚衰老的發(fā)生。皮膚衰老的研究一直是近年來的熱點，盡管已鑒定出許多衰老相關(guān)蛋白，但衰老的信號通路及其調(diào)節(jié)機制尚不清楚。 MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中發(fā)現(xiàn)的一類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的非編碼RNA，其大小長約20~25個核苷酸。miRNA芯片技術(shù)是一種快速有效檢測miRNA表達譜的方法，經(jīng)此方法篩選出的差異表達的miRNA，可通過質(zhì)粒、腺病毒、慢病毒轉(zhuǎn)染等方式上調(diào)/下調(diào)其表達，進一步進行功能學(xué)研究。 目的 本研究將采用多次低劑量UVB照射HDFs的方法，構(gòu)建應(yīng)激誘導(dǎo)的提前衰老（UVB-stress induced premature senescence, UVB-SIPS）模型，然后通過microRNA芯片技術(shù)篩選該模型中差異表達的miRNA并進行生物信息學(xué)分析，找出用UVB照射HDFs構(gòu)建的UVB-SIPS模型中差異表達miRNA，并對其中感興趣的miRNA-34c與老化相關(guān)基因p53、p21、p16及sirt1在UVB-SIPS中的作用進行初步研究。 方法 1.建立及驗證UVB照射誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細胞提前衰老模型 取健康青少年男子環(huán)切術(shù)切除的包皮，分離真皮HDFs后進行傳代培養(yǎng)，取10-15代細胞進行實驗，采用不同劑量的UVB照射細胞，觀察細胞衰老-β-半乳糖苷酶染色（SA-β-Gal）、G1期阻滯率及細胞凋亡率，以篩選最佳UVB照射劑量；并用Real-time PCR及western blotting檢測UVB-SIPS模型中衰老相關(guān)基因p53、p21、p16及sirt1的mRNA和蛋白表達。 2. microRNA芯片篩選差異表達的microRNA及生物信息學(xué)分析 首先進行microRNA芯片分析，以歸一化強度的|log2（Ratio）|≥2和P 0.05為條件篩選上述UVB-SIPS模型中差異表達的miRNA，通過TargetScan數(shù)據(jù)庫對部分差異表達的miRNA進行靶基因預(yù)測，并對所得靶基因進行基因功能的顯著性分析（GO-Analysis），構(gòu)建miRNA與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而得出該網(wǎng)絡(luò)中具有重要調(diào)控地位的核心miRNA和被調(diào)控的關(guān)鍵靶基因，并分析其基本功能。 3. miR-34c在UVB照射誘導(dǎo)的提前衰老模型中作用機制的研究 根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果與文獻報道，選擇UVB照射后表達上調(diào)的miR-34c為切入點，運用慢病毒感染技術(shù)沉默miR-34c的表達，再以前述所篩選出的最佳UVB劑量照射HDFs誘導(dǎo)提前衰老，觀察衰老相關(guān)生物學(xué)指標SA-β-Gal、細胞周期阻滯率以及衰老相關(guān)基因p53、p21、p16及sirt1的mRNA及蛋白表達。 結(jié)果 1.總劑量50mJ/cm2的UVB平均分5日照射后3d，可誘導(dǎo)人皮膚成纖維細胞進入提前衰老狀態(tài) 接受不同照光劑量（25mJ/cm2、50mJ/cm2、75mJ/cm2）的HDFs其SA-β-Gal陽性率及G1期阻滯率均明顯高于空白對照組（P0.05），以總劑量25mJ/cm2、50mJ/cm2的UVB照射的HDFs其凋亡率與空白對照組無明顯差異。當UVB照射總劑量達75mJ/cm2可明顯引起細胞凋亡（P＜0.05）。依此選擇構(gòu)建誘導(dǎo)UVB-SIPS模型的最佳照射總劑量為50mJ/cm2，平均分5日照射，每日劑量為10mJ/cm2。 2. miRNA芯片篩選出UVB-SIPS模型中差異表達的miRNA 相對于空白對照組細胞，在UVB-SIPS組細胞中以|log2（比）|≥2和P0.05為標準選擇有顯著表達差異的miRNA，篩選出8個上調(diào)的miRNA，分別為hsa-miR-1224-3p、hsa-miR-197-3p、hsa-miR-1976、has-miR-23a-5p、hsa-miR-34c-5p、hsa-miR-4701-5p、hsa-miR-574-5p和hsa-miR-766-3p；5個下調(diào)的miRNA，分別為hsa-miR-1185-1-3p、hsa-miR-1185-2-3p、hsa-miR-4638-5p、hsa-miR-4695-5p和hsa-miR-933。對上述miRNA進行生物信息學(xué)分析，并通過TargetScan數(shù)據(jù)庫預(yù)測這些miRNA的靶基因，構(gòu)建miRNA與基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從而得到該網(wǎng)絡(luò)中具有重要調(diào)控地位的核心miRNA和被調(diào)控的關(guān)鍵靶基因。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)上調(diào)miRNA預(yù)測靶基因功能主要集中于能量代謝、免疫反應(yīng)、色素代謝等，下調(diào)miRNA預(yù)測靶基因功能主要集中于成纖維細胞增值功能負調(diào)控、跨膜信號傳導(dǎo)等。 3. miR-34c對UVB照射誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細胞提前衰老有促進作用。 運用慢病毒感染HDFs沉默miR-34c表達后再次予前述構(gòu)建UVB-SIPS模型相同UVB劑量照射，SA-β-Gal陽性率及G1期阻滯率均較單純UVB照射組降低（P0.05），老化相關(guān)基因p53、p21、p16及sirt1的mRNA及蛋白表達均較單純UVB照射組降低（P0.05）。 結(jié)論 綜上所述，miR-34c通過影響老化相關(guān)基因p53、p21、p16及sirt1mRNA及蛋白的表達，對UVB照射誘導(dǎo)的HDFs提前衰老具有促進作用。
【關(guān)鍵詞】：成纖維細胞 UVB miRNA芯片 miR-34c 衰老相關(guān)基因
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R751
【目錄】：

• 全文技術(shù)流程圖5-6
• 全文主要縮略語6-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-14
• 第一部分 UVB 誘導(dǎo)的人皮膚成纖維細胞提前衰老（UVB-SIPS）模型的建立及驗證14-39
• 前言14-16
• 材料與方法16-31
• 結(jié)果31-39
• 第二部分 人皮膚成纖維細胞 UVB-SIPS 模型中差異表達 microRNA 的篩選、驗證及其生物信息學(xué)分析39-54
• 前言39-40
• 材料與方法40-44
• 結(jié)果44-54
• 第三部分 沉默miR-34c對人皮膚成纖維細胞UVB-SIPS模型衰老進程的抑制作用54-67
• 前言54-55
• 材料與方法55-59
• 結(jié)果59-67
• 討論67-74
• 全文小結(jié)74-75
• 文獻綜述75-81
• 參考文獻81-85
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況85-86
• 附錄86-89
• 致謝89

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本文編號：389110