發(fā)布時間：2022-02-16 09:27

　　[RASSF1A基因在黑色素瘤細(xì)胞和組織中表達(dá)下調(diào)]RASSFIA是定位于腫瘤高頻雜合性丟失區(qū)域3p21.3位點(diǎn)的抑瘤基因,編碼一個微管相關(guān)蛋白。該基因在多種實(shí)體瘤組織中因啟動子高甲基化而表達(dá)沉默,是迄今為止在腫瘤組織中甲基化程度最高的基因之一。前期多項研究指出,除了在上皮性腫瘤中發(fā)生甲基化之外,RASSF1A基因在惡性黑色素瘤細(xì)胞中也存在高頻甲基化,提示該基因在黑色素瘤的發(fā)生過程中也可能存在表達(dá)異常。在本研究中,我們首次采用免疫組織化學(xué)及western blot的方法研究了RASSFIA基因在正常皮膚組織、皮膚色素痣以及惡性黑色素瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),RASSF1A蛋白在正常皮膚色素細(xì)胞和色素痣細(xì)胞中高表達(dá),而在惡性黑色素瘤組織中表達(dá)下調(diào)甚至缺失,并與腫瘤的轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)。RASSFIA蛋白在非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系中有微弱表達(dá),而在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細(xì)胞系中表達(dá)缺失。該結(jié)果證實(shí)了RASSFIA在黑色素瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),強(qiáng)烈提示RASSFIA參與了黑色素瘤的發(fā)生與演進(jìn)過程。[RASSFIA基因具有抑制黑色素瘤細(xì)胞生長、增殖的作用]以往關(guān)于RASSFIA基因功能的研究絕大部分... 

【文章來源】：中南大學(xué)湖南省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：105 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮寫詞簡表
目錄
技術(shù)路線
第一章 前言
第二章 材料與方法
    1 材料
        1.1 細(xì)胞
        1.2 菌株和質(zhì)粒載體
        1.3 試劑
        1.4 主要儀器
    2 方法
        2.1 免疫組化
        2.2 pIRES-RASSF1A載體的構(gòu)建
        2.3 細(xì)胞RNA制備
        2.4 培養(yǎng)細(xì)胞總蛋白制備
        2.5 線粒體和胞漿蛋白的抽提
        2.6 SDS-PAGE凝膠電泳
        2.7 基因瞬時轉(zhuǎn)染
        2.8 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染
        2.9 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞系的建立
        2.10 免疫熒光實(shí)驗(yàn)
        2.11 細(xì)胞生長曲線測定
        2.12 平板集落形成實(shí)驗(yàn)
        2.13 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)
        2.14 FCM檢測細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡
        2.15 Hoechst33258染色檢測細(xì)胞凋亡
        2.16 人類全基因組表達(dá)譜芯片雜交(由博奧生物有限公司完成)
        2.17 差異表達(dá)基因的raltime RT-PCR驗(yàn)證
第三章 結(jié)果
    第一部分 RASSF1A基因在黑色素瘤細(xì)胞和組織中的表達(dá)
        3.1.1 RASSF1A基因在黑色素瘤組織中的表達(dá)
        3.1.2 RASSF1A表達(dá)與惡黑臨床相關(guān)分析
        3.1.3 RASSF1A蛋白在黑色素瘤細(xì)胞系中的表達(dá)
    第二部分 RASSF1A基因過表達(dá)對A375細(xì)胞的影響
        3.2.1 RASSF1A真核表達(dá)載體的構(gòu)建
        3.2.2 RASSF1A穩(wěn)定轉(zhuǎn)染黑色素瘤細(xì)胞系的建立
        3.2.3 RASSF1A對A375細(xì)胞生長與增殖的影響
        3.2.4 RASSF1A對A375細(xì)胞集落形成能力的影響
        3.2.5 RASSF1A對A375細(xì)胞形態(tài)影響
        3.2.6 RASSF1A抑制A375細(xì)胞裸鼠移植瘤的形成
        3.2.7 RASSF1A促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡
        3.2.8 RASSF1A對A375細(xì)胞周期的影響
        3.2.9 RASSF1A對細(xì)胞周期調(diào)控分子表達(dá)的影響
        3.2.10 RASSF1A通過降低cyclin D1蛋白穩(wěn)定性抑制其表達(dá)
    第三部分 RASSF1A對黑色素瘤細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響
        3.3.1 RASSF1A基因?qū)375細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響
        3.3.2 差異表達(dá)基因的生物信息學(xué)分析
        3.3.3 差恂表達(dá)基因KEGG和BIOCARTA數(shù)據(jù)庫pathway分析
        3.3.4 差異表達(dá)基因的進(jìn)一步驗(yàn)證
    第四部分 RASSF1A調(diào)控惡黑細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的分子機(jī)制
        3.4.1 RASSF1A上調(diào)ASK1表達(dá)激活p38 MAPK信號途徑
        3.4.2 RASSF1A對cytochrome c亞細(xì)胞分布的影響
        3.4.3 RASSF1A誘導(dǎo)惡黑細(xì)胞凋亡的作用部分依賴于ASK1
        3.4.4 RASSF1A抑制了AKT/mTOR信號通路的活化
        3.4.5 AKT可以逆轉(zhuǎn)RASSF1A對信號通路的調(diào)節(jié)作用
第四章 討論
    4.1 RASSF1A蛋白在惡黑組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)
    4.2 RASSF1A具有抑制惡黑A375細(xì)胞生長與增殖的作用
    4.3 RASSF1A下調(diào)cyclin D1和p-Rb表達(dá),引起A375細(xì)胞周期G1-S期阻滯
    4.4 RASSF1A促進(jìn)A375細(xì)胞凋亡
    4.5 RASSF1A調(diào)控的A375差異基因表達(dá)譜的構(gòu)建
    4.6 RASSF1A通過上調(diào)ASK1促進(jìn)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制
    4.7 RASSF1A抑制了惡黑細(xì)胞AKT/mTOR信號通路
    4.8 Summary:RASSF1A抑制了惡黑細(xì)胞生物學(xué)表型的分子機(jī)制
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述
致謝
個人簡歷


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]惡性黑色素瘤的研究進(jìn)展[J]. 烏新春,段晰所.  承德醫(yī)學(xué)院學(xué)報. 2008(03)
[2]人類表觀基因組計劃[J]. 黃慶,郭穎,府偉靈.  生命的化學(xué). 2004(02)
[3]北京城區(qū)1993-1997年惡性腫瘤發(fā)病率分析[J]. 祝偉星,王啟俊,李玲,邢秀梅.  腫瘤防治雜志. 2003(08)



本文編號：3627729