本文關(guān)鍵詞：靶向Notch1的siRNA抑制小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞增殖的體內(nèi)外研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景： 惡性黑色素瘤(Malignant Melanoma, MM),是起源于神經(jīng)脊黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤。近幾十年來,惡性黑色素瘤在全球的發(fā)病率迅猛升高,成為所有惡性腫瘤中發(fā)病率增長最快的腫瘤,年增長率幾乎達(dá)到3-5%。其中白色人種發(fā)病率明顯高于其他人種,澳大利亞昆士蘭地區(qū)和美國的南亞利桑那州為惡性黑色素瘤的高發(fā)地區(qū),我國和日本等亞洲國家的黑色素瘤發(fā)病率與歐美國家相比相對較低,但近年來其發(fā)病率呈迅猛上升趨勢。惡性黑色素瘤是世界上惡性程度較高的腫瘤之一,該病起病隱匿,易發(fā)生轉(zhuǎn)移,當(dāng)前已成為發(fā)達(dá)國家皮膚癌死亡率最高的腫瘤。它的預(yù)后因素與年齡、性別、部位、腫瘤的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、是否潰瘍及手術(shù)方式等相關(guān)。對于早期的局限性病變,外科手術(shù)切除是黑色素瘤的最佳治療原則,然而術(shù)后發(fā)生轉(zhuǎn)移的幾率大。對于晚期轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤患者,絕大多數(shù)需接受全身性系統(tǒng)治療,但是黑色素瘤細(xì)胞對傳統(tǒng)的放、化療均不敏感,所以尋求治療惡性黑色素瘤的治療靶點迫在眉睫。 Notch信號通路不僅對正常細(xì)胞的分化起作用,而且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相連,影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等。在哺乳動物中,Notch是由4個受體(Notchl-4)及5個配體(Delta-likel,3-4, and Jaggedl-2)組成。這條通路激活是通過Notch受體與相鄰細(xì)胞表面的配體結(jié)合,引起Notch受體細(xì)胞外結(jié)構(gòu)的改變,導(dǎo)致γ-分泌酶復(fù)合體切割并釋放Notch受體胞內(nèi)區(qū)NICD(Notchintracellular domain)進(jìn)入細(xì)胞核,NICD通過其RAM(RBP Jk associated molecular)結(jié)構(gòu)域與CSL(CBF-1/suppressor of hairless/Lag-1)蛋白結(jié)合導(dǎo)致共抑制復(fù)合物解離,并募集共活化分子MAML1(mastermind-like1)組成共三聚體,從而啟動下游基因的轉(zhuǎn)錄。在Notch的4個受體當(dāng)中,Notch1是在腫瘤組織中最常被檢測到的家族成員,對腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及演進(jìn)的過程起到了關(guān)鍵性作用。值得注意的是,Notch信號通路在腫瘤形成過程中既可以充當(dāng)促癌基因角色又可以充當(dāng)抑癌基因角色,主要取決于不同腫瘤以及其不同的發(fā)展階段。近年來對惡性黑色素瘤的研究發(fā)現(xiàn),Notch1呈高表達(dá)狀態(tài)并主要起著促癌作用,Notch1蛋白的高表達(dá)和天然活化阻止黑色素細(xì)胞正常分化,從而導(dǎo)致黑色素腫瘤的發(fā)生,間接參與了黑色素細(xì)胞的早期惡變。 siRNA干擾技術(shù)是近年來基因表達(dá)調(diào)控的研究熱點之一,它是由小分子干擾RNA引發(fā)誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后的基因沉默過程。與傳統(tǒng)的腫瘤抑制治療技術(shù)相比,siRNA不僅簡單有效,而且能特異地下調(diào)細(xì)胞中基因的表達(dá)。目前,siRNA靶向抑制Notch1基因進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞生長與增殖的相關(guān)現(xiàn)象已在膠質(zhì)瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、急性T淋巴細(xì)胞白血病等腫瘤疾病的研究中得到了證實。 但在惡性黑色素瘤中,靶向Notch1基因的siRNA是否也可以下調(diào)Notch及其下游信號傳導(dǎo)通路來發(fā)揮其生物學(xué)作用,還需要我們進(jìn)一步證實。因此,本研究擬用RNA干擾技術(shù)來探討Notch1在惡性黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。以小鼠惡性黑色素瘤B16F1細(xì)胞為研究對象,應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)Notch1的表達(dá),體外觀察其對黑色素瘤細(xì)胞增殖的影響；同時,擬將轉(zhuǎn)染后細(xì)胞注射至同基因來源的C57BL/6小鼠皮下,觀察腫瘤的生長速度及Notch1、增殖活躍性指標(biāo)細(xì)胞核相關(guān)抗原Ki-67、增殖細(xì)胞核抗原PCNA的表達(dá)變化,從而明確Notch1在體內(nèi)對黑色素瘤增殖的影響。 目的： 1.探討通過siRNA技術(shù)沉默Notch1進(jìn)而抑制小鼠惡性黑色素瘤生長與細(xì)胞增殖的可行性。 2.探討Notch1是否能作為治療惡性黑色素瘤的靶點,進(jìn)而為尋求治療惡性黑色瘤的新方法提供理論依據(jù)。 材料與方法： 1.主要的實驗材料 1.1細(xì)胞及實驗動物來源 小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞株B16F1由美國芝加哥大學(xué)孟玉茹教授贈與；C57BL/6雌性小鼠,6-8周齡,體質(zhì)量18-22g,購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院實驗動物研究中心SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)。 1.2實驗試劑 胎牛血清、高糖DLipofectamineTM2000、Notchl siRNA Oligo及陰性對照、Trizol、PrimeScript(?) RT reagent試劑盒、SYBR(?) Premix Ex TaqTM試劑盒、Notchl引物、山羊抗小鼠的Notchl多克隆抗體、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、PVDF膜、MTT試劑盒、DMSO、結(jié)晶紫染料、兔抗小鼠的Ki-67單克隆抗體、兔抗小鼠的PCNA多克隆抗體、辣根過氧化酶(HRP)標(biāo)記山羊二抗試劑盒、HRP標(biāo)記兔二抗試劑盒、DAB顯色劑、AEC顯色劑、蘇木素、伊紅、無水乙醇、95%酒精、1%鹽酸酒精等。 1.3實驗儀器 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、恒溫循環(huán)水浴鍋、光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)、臺式離心機(jī)、電泳系統(tǒng)、酶標(biāo)儀、PCR儀、熒光定量PCR反應(yīng)儀、分光光度計、石蠟切片機(jī)、石蠟包埋機(jī)、-80℃冰箱、通風(fēng)柜、微波爐、電子秤、游標(biāo)卡尺、眼科剪、眼科鑷、lml注射器、培養(yǎng)皿、吸管、微量移液器、試管、EP管、凍存管、載玻片、蓋玻片等。 2.細(xì)胞培養(yǎng) B16F1細(xì)胞株用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況,每2-3天行傳代培養(yǎng)。 3.實驗流程 3.1靶向Notchl基因的siRNA轉(zhuǎn)染小鼠惡性黑色素瘤B16F1細(xì)胞株 利用siDESIEN網(wǎng)站設(shè)計靶向Notchl基因的siRNA,委托由上海吉瑪生物公司合成。前期從預(yù)先設(shè)計的6對序列中選出1對作為目的siRNA,采用Invitrogen公司的lipofectamineTM2000介導(dǎo)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染了靶向Notch1基因siRNA的B16F1細(xì)胞用siNotch1表示、轉(zhuǎn)染空載體siRNA陰性對照(negative control)的B16F1細(xì)胞用siNC表示、只加轉(zhuǎn)染試劑lipofectamineTM2000對照的未處理B16F1細(xì)胞用mock表示。轉(zhuǎn)染后采用RT-PCR以及Western blot驗證沉默效率。 3.2siNotch1對B16F1細(xì)胞體外生長特性的比較分析 經(jīng)上述siRNA技術(shù)瞬時轉(zhuǎn)染的小鼠惡性黑色素瘤B16F1細(xì)胞株,行MTT比色法檢測細(xì)胞增殖能力以及細(xì)胞克隆試驗觀察三組細(xì)胞克隆形成能力,克隆形成率的計算方式為形成克隆的數(shù)目／接種細(xì)胞的數(shù)目×100%,體外初步評價Notch1對惡性黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。 3.3siNotch1對B16F1細(xì)胞體內(nèi)生長特性的比較分析 分別用轉(zhuǎn)染后的三組細(xì)胞建立C57BL/6小鼠惡性黑色素瘤模型,動物皮下成瘤后每3-4天進(jìn)行一次相應(yīng)siRNA的瘤內(nèi)注射,以保證穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染效果,接種后的第31天斷頸處死小鼠,取腫瘤標(biāo)本比較各組腫瘤體積并行HE染色觀察組織病理改變以及免疫組化檢測腫瘤組織Notch1蛋白、細(xì)胞核相關(guān)抗原Ki-67及增殖細(xì)胞核抗原PCNA的表達(dá)情況。免疫組化染色結(jié)果采用雙盲法判定,每張切片隨機(jī)選擇5個高倍視野(x400),每個視野計數(shù)100個細(xì)胞,計算陽性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的占百分比。 4.數(shù)據(jù)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學(xué)處理。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用單因素方差分析RT-PCR、Western blot、細(xì)胞克隆及免疫組化實驗的統(tǒng)計學(xué)差異,采用析因方差分析MTT細(xì)胞增殖的檢測以及腫瘤體積觀察。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗,當(dāng)P0.05時差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)果： 1.siNotchl成功轉(zhuǎn)染小鼠惡性黑色素瘤B16F1細(xì)胞株結(jié)果表明,通過RT-PCR和Western blot檢測,siNotchl轉(zhuǎn)染B16F1細(xì)胞后的Notchl表達(dá)水平較空載體siNC組和未處理mock組顯著降低(P0.05),而siNC和mock組細(xì)胞間的Notchl表達(dá)水平無差異(P0.05)。 2. siNotchl體外抑制小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖以及克隆形成MTT實驗結(jié)果表明,從轉(zhuǎn)染后的第2天開始,siNotchl沉默組的增殖速度顯著慢于siNC空載體組和未處理mock組(P0.05)。同樣,細(xì)胞克隆形成實驗結(jié)果顯示siNotchl組、siNC組以及mock組細(xì)胞的克隆形成率分別為(0.157±0.021)%、(0.760±0.030)%、(0.787±0.031)%, siNotch1沉默組顯著低于siNC和mock組(P0.05),而空載體siNC組和未處理mock組細(xì)胞間克隆形成率無差異(P0.05)。 3. siNotchl體內(nèi)抑制小鼠惡性黑色素瘤的成瘤能力結(jié)果發(fā)現(xiàn),第31天處死小鼠,測量腫瘤體積,三組的腫瘤平均體積分別為1307.947±161.914mm3,2970.683±140.945mm3和3078.987±252.257mm3,siNotchl組的腫瘤體積顯著小于siNC和mock組,有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),而siNC和mock組之間的瘤體積則無顯著差異(P0.05)。HE染色發(fā)現(xiàn)siNotchl沉默組腫瘤組織鏡下見多處大片壞死灶,腫瘤細(xì)胞異型性不明顯,siNC空載體組及mock未處理組腫瘤細(xì)胞異型性明顯,組織中含豐富的新生血管,壞死灶較少。免疫組化結(jié)果顯示siNotchl沉默組、siNC空載體組及mock未處理組Notchl蛋白的陽性細(xì)胞百率分別為(41.44±6.84)%、(87.20±4.53)%、(90.36±5.25)%,siNotchl組明顯低于另兩組(P0.05)。同樣,增殖指標(biāo)Ki-67和PCNA的表達(dá)在siNotchl組的表達(dá)也顯著低于其他兩對照組,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論： 1.在小鼠惡性黑色素瘤中,通過siRNA技術(shù)沉默Notchl是可行的,并且在體內(nèi)外抑制了小鼠惡性黑色素瘤B16F1細(xì)胞的增殖與腫瘤的生長。 2. Notchl基因在小鼠惡性黑色素瘤細(xì)胞的增殖中起至關(guān)重要的作用,可望成為治療惡性黑色素瘤的有效靶點,而siNotchl可能是治療惡性黑色素瘤的有效途徑。
【關(guān)鍵詞】：小鼠惡性黑色素瘤 Notch1 siRNA 動物模型
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-31
• 參考文獻(xiàn)24-31
• 第一部分 體外實驗探討Notch1沉默對黑色素瘤細(xì)胞株B16F1增殖功能的影響31-50
• 一、材料與方法31-40
• 二、結(jié)果40-46
• 三、討論46-48
• 參考文獻(xiàn)48-50
• 第二部分 體內(nèi)實驗探討Notch1沉默對黑色素瘤細(xì)胞株B16F1增殖功能的影響50-65
• 一、材料與方法50-57
• 二、結(jié)果57-61
• 三、討論61-63
• 參考文獻(xiàn)63-65
• 全文總結(jié)65-66
• 本研究的局限性與進(jìn)一步研究的方向66-67
• 縮略語中英文對照67-70
• 成果70-71
• 致謝71-72

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本文編號：344181