本文關(guān)鍵詞：miR-340調(diào)控UVB誘導的黑素細胞樹突形成的機制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：人體皮膚的顏色主要受色素沉著過程的影響，色素沉著過程也就是黑素代謝的生理過程，包括黑素合成、轉(zhuǎn)運、再分布和降解。在多種外界環(huán)境因素和生理因素影響下，機體形成一個復(fù)雜而有序的色素沉著調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。色素沉著異常在臨床上表現(xiàn)為多種色素障礙性皮膚病，發(fā)病機制尚不完全清楚。 黑素轉(zhuǎn)運是色素沉著過程中最為關(guān)鍵的一個環(huán)節(jié)，黑素合成后，必須由黑素細胞進入角質(zhì)形成細胞，才能形成皮膚顏色并保護機體免受紫外線輻射損傷。黑素轉(zhuǎn)運主要分為①細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運：黑素細胞內(nèi)合成的黑素小體由核周向樹突末端運動；②細胞間轉(zhuǎn)運：運動至樹突末端的黑素小體分泌進入周圍角質(zhì)形成細胞。樹突是黑素細胞的特征性結(jié)構(gòu)，作為黑素小體的運動管道和連接黑素細胞與角質(zhì)形成細胞的重要中介，樹突在黑素轉(zhuǎn)運中起著至關(guān)重要的作用。紫外線是引起色沉增加的重要影響因素，紫外線照射在刺激黑素細胞黑素合成的同時，通過增加樹突數(shù)量及長度實現(xiàn)更高效的黑素轉(zhuǎn)運。有學者通過體外重建表皮模型證實中波紫外線（UVB）照射顯著促進黑素小體轉(zhuǎn)運，鏡下觀察黑素顆粒在表皮全層分布，黑素細胞數(shù)量及形態(tài)發(fā)生明顯變化。我們在前期實驗中也證實UVB照射后可以誘導人黑素細胞PIG1樹突數(shù)量及長度顯著增加，黑素小體向角質(zhì)形成細胞的傳遞增強，但具體機制尚未完全闡明。 microRNA（miRNA）是一類長約22個nt的非編碼單鏈小RNA分子，可以通過與其調(diào)控的靶基因之間特異性的結(jié)合，降解靶mRNA或抑制翻譯等方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達，進而參多種生物學功能，在細胞內(nèi)具有重要的調(diào)節(jié)作用。miRNAs表達的時序性和組織特異性提示miRNAs的分布可能決定細胞和組織的功能特異性。既往有研究表明一些microRNAs參與調(diào)控神經(jīng)細胞樹突棘發(fā)育[6-8]，還有很多報道m(xù)iRNAs分子通過調(diào)控細胞骨架蛋白等信號通路，在細胞形態(tài)學發(fā)生、遷移及運動中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。此外，研究發(fā)現(xiàn)紫外線可以引起細胞內(nèi)microRNA表達譜變化，miRNAs分子可以在轉(zhuǎn)錄后水平參與調(diào)控對UV誘導DNA損傷的應(yīng)答機制]。以上提示我們在黑素細胞內(nèi)可能存在特定的miRNAs分子參與調(diào)控樹突形態(tài)。因此，本課題擬在前期研究的基礎(chǔ)上，選擇100mJ/cm2UVB作為誘導條件，尋找與人表皮黑素細胞樹突形成相關(guān)的microRNA分子，研究miRNAs調(diào)控黑素細胞形態(tài)的分子機制及其在UVB誘導的樹突形成中的作用，完善黑素代謝基礎(chǔ)理論，探討miRNAs參與紫外線誘導皮膚色沉的分子機制，并為色素障礙性皮膚病的治療以及皮膚美容產(chǎn)品的研發(fā)提供新的思路和理論依據(jù)。 實驗方法 使用100mJ/cm2UVB照射人表皮黑素細胞PIG1，與UVB照射前的黑素細胞進行microRNA表達譜差異分析，再通過Real-timePCR驗證芯片結(jié)果，初步篩選相關(guān)的miRNA分子。轉(zhuǎn)染miRNA分子進行形態(tài)學和功能學研究，觀察黑素細胞樹突數(shù)量及長度的變化，觀察骨架蛋白F-actin和黑素小體在樹突的分布變化。生物信息預(yù)測軟件預(yù)測miRNA可能調(diào)控的靶基因，雙熒光素酶報告載體驗證預(yù)測的靶基因，RT-PCR、WesternBlot證實miRNA分子對靶基因的調(diào)控作用。 結(jié)果 1.對microRNA芯片表達譜進行分析后，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，UVB照射后很多microRNA表達水平發(fā)生變化，UVB照射后3h與對照組相比有12個miR分子表達變化（Foldchange≥2.0），其中2個下調(diào)，10個上調(diào)。UVB照射后24h，有3個顯著變化的miR分子（Foldchange≥2.0），其中1個上調(diào)，3個下調(diào)。 2.在黑素細胞中轉(zhuǎn)染miR-340擬似物和抑制物后，分別成功上調(diào)和下調(diào)miR-340表達水平，與對照組相比，上調(diào)miR-340表達水平后，黑素細胞樹突數(shù)量、長度均顯著增加（p＜0.05）；免疫熒光觀察到細胞內(nèi)F-actin形成的應(yīng)力纖維解聚，黑素小體在樹突末端的分布增加。 3.通過生物學軟件我們預(yù)測RhoA是miR-340的靶基因，報告基因?qū)嶒炞C實，miR-340可以與RhoA3’UTR的預(yù)測位點特異性結(jié)合，RT-PCR和Westernblot實驗發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-340表達水平，RhoA的mRNA表達水平無明顯變化，而RhoA蛋白水平顯著下調(diào)；下調(diào)miR-340表達水平，RhoA的mRNA無變化，，蛋白水平上調(diào)。 結(jié)論 1.UVB照射可以誘導人黑素細胞PIG1的microRNA表達譜發(fā)生變化，靶基因預(yù)測和功能學分析提示microRNA可能參與多種生物學功能；UVB照射后microRNAs表達的時間差異性，提示UVB誘導的miRNAs表達具有瞬時性，并且多集中于UVB照射早期。 2.miR-340在UVB照射前后的人黑素細胞表達具有差異性；miR-340能夠促使PIG1細胞內(nèi)應(yīng)力纖維解聚，黑素細胞樹突長度及數(shù)量增加，黑素小體向樹突末端的轉(zhuǎn)運增加，說明miR-340在黑素細胞樹突形成及黑素轉(zhuǎn)運中的調(diào)控作用。 3.miR-340可能通過與靶基因RhoA3’UTR區(qū)的作用位點特異性結(jié)合抑制RhoA表達，參與黑素細胞樹突形成。RhoA是調(diào)控骨架蛋白F-actin的重要分子，它可以促進F-actin聚合形成應(yīng)力纖維，增加細胞張力及粘附力，使黑素細胞樹突回縮、變短，是黑素細胞樹突形成的負調(diào)控分子。miR-340對黑素細胞樹突形成的促進作用可能是通過對RhoA的靶向抑制作用實現(xiàn)的。
【關(guān)鍵詞】：microRNA 色素沉著 黑素細胞 樹突形成 Rho-GTPase RhoA
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R751
【目錄】：

• 縮略語表4-6
• 中文摘要6-9
• ABSTRACT9-13
• 前言13-16
• 文獻回顧16-25
• 1. 黑素細胞樹突在黑素小體的轉(zhuǎn)運中的作用17-18
• 2. Rho-GTPase 對黑素細胞樹突的調(diào)控18-21
• 3. miRNA 對黑素細胞樹突的調(diào)控21-22
• 4. UVB 照射對黑素細胞樹突的影響22-25
• 第一部 分黑素細胞樹突形成相關(guān)分子的篩選及驗證25-38
• 1 材料25-26
• 2 方法26-32
• 3 結(jié)果32-36
• 4 討論36-38
• 第二部 分MIR -340參與調(diào)控黑素細胞樹突形成的功能學研究及作用機制38-55
• 1 材料38-39
• 2 方法39-45
• 3 結(jié)果45-51
• 4 討論51-55
• 小結(jié)55-56
• 參考文獻56-64
• 個人簡歷和研究成果64-65
• 致謝65

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本文編號：339934