本文關(guān)鍵詞：緩激肽受體在炎性皮損區(qū)異常癢感覺(jué)中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：搔癢(itch, or pruritus)是一系列皮膚疾病的主要癥狀,輕微的搔癢具有自我保護(hù)性生理作用,而慢性搔癢則是一個(gè)重要的臨床問(wèn)題。在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)搔癢被認(rèn)為是亞疼痛感受的一種,因此搔癢與疼痛是否通過(guò)同樣的傳導(dǎo)通路上傳外界刺激的爭(zhēng)議一直以來(lái)都存在。通常疼痛刺激可以減輕搔癢的感覺(jué)。緩激肽(bradykinin, BK)是公認(rèn)的致痛劑,皮內(nèi)注射后可產(chǎn)生燒灼樣疼痛,但對(duì)于特應(yīng)性皮炎患者來(lái)說(shuō),緩激肽卻可以引起皮損區(qū)明顯的搔癢感,因而這是病理狀態(tài)下的一種異常癢感覺(jué)。但目前用于研究皮炎的動(dòng)物模型均會(huì)出現(xiàn)自發(fā)性搔抓,干擾目的指標(biāo)的觀察。而由完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant,CFA)引起的慢性炎癥模型可以排除這一干擾。我們的前期研究則發(fā)現(xiàn),致痛劑辣椒素可引起CFA炎性皮損區(qū)的頸背部搔抓,并且這種搔抓可被納洛酮抑制,說(shuō)明這是一種搔癢相關(guān)行為。但緩激肽是否也可引起CFA炎性皮損區(qū)搔癢相關(guān)反應(yīng)卻不得而知。 緩激肽是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)最重要的活性產(chǎn)物,在機(jī)體心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等全身各系統(tǒng)中有重要的生理和病理功能。緩激肽為九肽肽段,主要通過(guò)與兩種亞型的G蛋白耦聯(lián)受體(G-protein-coupled receptor,GPCR)受體,即緩激肽B1受體(bradykinin B1receptor, B1R)和緩激肽B2受體(bradykinin B2receptor, B2R)結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)作用。緩激肽局部注射使人產(chǎn)生疼痛,而當(dāng)B1R被選擇性拮抗后,或者使用B1R基因敲除動(dòng)物模型,緩激肽局部注射引起的疼痛反應(yīng)會(huì)減輕,提示B1R可能介導(dǎo)疼痛的傳導(dǎo)。B2R則分布廣泛,在中樞及外周大多數(shù)組織中存在生理性表達(dá)。而有關(guān)B1R和B2R在搔癢傳導(dǎo)機(jī)制中的作用的研究卻鮮有報(bào)道。 臨床上不僅常見(jiàn)的疼痛刺激可引起特應(yīng)性皮炎患者皮損區(qū)的搔癢,即使輕微的接觸,例如棉簽輕觸在患者的皮損區(qū),也會(huì)誘發(fā)明顯的搔癢。這種輕微的非傷害性機(jī)械刺激即可誘發(fā)搔癢的現(xiàn)象被稱作觸誘發(fā)癢(alloknesis)。觸誘發(fā)癢也是一種異常的癢感覺(jué),并且提示了可能存在一種中樞敏感機(jī)制,由輕微的觸碰等非傷害性刺激即可產(chǎn)生明顯的癢感。本研究亦計(jì)劃在CFA炎性皮損區(qū)制作觸誘發(fā)癢反應(yīng)模型,并對(duì)將對(duì)緩激肽受體在觸誘發(fā)癢反應(yīng)中的作用做進(jìn)一步研究。 第一章緩激肽受體在致痛劑引起搔癢中的作用 目的 本研究將通過(guò)建立CFA炎癥動(dòng)物模型,并首次在此炎癥模型的基礎(chǔ)上研究致痛劑緩激肽的致癢作用,再進(jìn)一步探討B(tài)1R和B2R在這種異常癢感覺(jué)中所起的作用,然后對(duì)可能的下游通路進(jìn)行探索。 材料與方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究選用雄性C57BL/6J小鼠,體重20-25g,購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用及處理方法均符合廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的要求,并盡可能減少使用動(dòng)物的數(shù)量。 2.動(dòng)物模型制備及行為學(xué)觀察 1)CFA頸背部注射引起搔抓反應(yīng)的觀察 小鼠頸背部局部皮內(nèi)注射CFA(50μL,對(duì)照組注射生理鹽水)后,并在第0、6、24、48、72和96h觀察小鼠用后肢搔抓CFA注射部位的次數(shù),小鼠完成從舉起后肢搔抓注射部位到放下后肢全過(guò)程為一次搔抓,記錄每只小鼠30min內(nèi)的搔抓次數(shù)。 2)緩激肽引起CFA炎性皮損區(qū)搔癢的行為學(xué)觀察 小鼠在接受CFA(50μL)頸背部皮內(nèi)注射96h之后,于實(shí)驗(yàn)前30min放置于透明塑料盒內(nèi)預(yù)適應(yīng)。然后用胰島素注射針(30G針頭)進(jìn)行皮內(nèi)注射不同濃度的緩激肽(0～1mmol/L,50μL),頸背部注射藥物后立即放入塑料盒內(nèi)觀察小鼠用后肢搔抓緩激肽注射部位的次數(shù),每只小鼠觀察30min。 3.B1R與iNOS在CFA炎性皮損區(qū)的表達(dá)情況 小鼠頸背部注射CFA(或者生理鹽水)96h后,在七氟醚麻醉后取頸背部炎性皮損區(qū)(或者生理鹽水對(duì)照組)全層皮膚經(jīng)過(guò)4%多聚甲醛固定、20%和30%蔗糖溶液脫水、冰凍切片、抗原修復(fù)與封閉、孵育一抗與二抗、封片等步驟后用熒光顯微鏡在200倍物鏡下觀察B1R與iNOS的共表達(dá)情況。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究各組數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,運(yùn)用SPSS13.0版統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。兩組間數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(正態(tài)分布并且方差齊時(shí))或者近似法t’檢驗(yàn)(方差不齊時(shí))；組間多重比較采用單因素方差分析中的Dunnett檢驗(yàn)(正態(tài)分布并且方差齊時(shí))或者Dunnett-T3檢驗(yàn)(方差不齊時(shí))。重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析中的Bonferroni檢驗(yàn)；析因設(shè)計(jì)資料采用兩因素析因設(shè)計(jì)方差分析。P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.CFA頸背部注射引起的搔抓反應(yīng) 小鼠頸背部皮內(nèi)注射CFA(50μL)可在48h內(nèi)可產(chǎn)生明顯的搔抓行為,但72h后,CFA則基本不引起明顯的搔抓行為。因此,為減小CFA炎癥對(duì)緩激肽引起搔癢的影響,我們均在CFA注射96h(4d)后進(jìn)行本研究其他的各項(xiàng)實(shí)驗(yàn)。 2.緩激肽引起CFA炎性皮損區(qū)的搔抓反應(yīng) CFA致炎4d后,我們?cè)谖褰M小鼠的CFA炎性皮損區(qū)皮內(nèi)注射濃度分別為0～1.0mmol/L的緩激肽50μL,結(jié)果顯示與對(duì)照組相比,0.1、0.5和1.0mmol/L的緩激肽均可引起小鼠頸背部明顯的搔抓反應(yīng)(*P0.05),并且呈現(xiàn)劑量依賴性,并且在濃度為0.5和1mmol/L的搔抓次數(shù)趨于平穩(wěn),因此本研究接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)中緩激肽的濃度均采用1mmol/L 接下來(lái)CFA致炎第4d至第35d分別在炎性皮損區(qū)皮內(nèi)注射緩激肽(1mmol/L)。結(jié)果顯示緩激肽引起的搔抓反應(yīng)在CFA致炎第4d至第7d趨于平穩(wěn),而從第14d起開(kāi)始,緩激肽引起的搔抓開(kāi)始逐漸下降,這提示緩激肽引起的搔抓反應(yīng)與時(shí)間效應(yīng)間有負(fù)相關(guān)關(guān)系。因此在本研究接下來(lái)的各步實(shí)驗(yàn)中我們均在CFA致炎第4d注射濃度為1mmol/L緩激肽50μL來(lái)觀察搔抓反應(yīng)。 3.B1R和B2R在緩激肽引起搔癢中的作用 腹腔注射10mg/kg的B1R拮抗劑(DALBK)可分別使緩激肽(1mmol/L)和B1R激動(dòng)劑(0.4mmol/L)引起的小鼠30min內(nèi)的搔抓次數(shù)明顯減少(*P0.05),而DALBK (5nmol)與緩激肽混合后局部注射卻對(duì)搔抓反應(yīng)物明顯影響。B2R拮抗劑(D-Arg-[Hyp3,D-Phe7]-BK,10mg/kg)腹腔注射或者與緩激肽混合后局部注射均可使小鼠30min內(nèi)的搔抓次數(shù)顯著增加(*P0.05)。免疫熒光染色結(jié)果也表明B1R在CFA炎性皮損區(qū)有較突出表達(dá)。這提示B1R介導(dǎo)炎性皮損區(qū)疼痛向搔癢的轉(zhuǎn)化,而B(niǎo)2R的作用則與之相反。辣椒素引起的搔癢依賴于TRPV1,而腹腔注射capsazepine (TRPV1抑制劑,4mg/kg)對(duì)緩激肽引起的搔抓反應(yīng)無(wú)明顯影響,說(shuō)明緩激肽引起的搔癢是非TRPV1依賴性的。 4. iNOS和NF-κB在緩激肽引起搔癢中的作用 腹腔注射L-NIL (iNOS抑制劑,5mg/kg),或者PDTC (NF-κB抑制劑,10mg/kg)均可顯著減少緩激肽(1mmol/L)在炎性皮損區(qū)引起的搔抓反應(yīng)(’P0.05),說(shuō)明NF-κB/iNOS可能參與介導(dǎo)緩激肽引起CFA炎性皮損區(qū)的搔癢反應(yīng)。 第二章緩激肽受體在觸誘發(fā)癢反應(yīng)中的作用 目的 研究擬利用CFA炎性小鼠,在排除其自發(fā)性搔抓的情況下,觀察非傷害性機(jī)械刺激否會(huì)引起CFA炎性皮損區(qū)的觸誘發(fā)癢行為,進(jìn)一步探討緩激肽B1R和B2R在觸誘發(fā)癢這一異常癢感覺(jué)中所起的作用。 材料與方法 1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本研究選用雄性C57BL/6J小鼠,體重20-25g,購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用及處理方法均符合廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)的要求,并盡可能減少使用動(dòng)物的數(shù)量。 2.動(dòng)物模型制備及行為學(xué)觀察 小鼠在接受CFA (50μL)頸背部皮內(nèi)注射96h之后,于實(shí)驗(yàn)前30min放置于透明塑料盒內(nèi)預(yù)適應(yīng)。然后用von Frey細(xì)絲(彎曲力度：1.6mN)垂直輕打在小鼠頸背部炎性皮損區(qū)邊緣,每次打3個(gè)不同的點(diǎn)。若每次機(jī)械刺激后小鼠完成從舉起后肢搔抓注射部位到放下后肢全過(guò)程為一次搔抓,記為“1”分；若未引起搔抓行為,記為“0”分。每隔5min重復(fù)一次上述操作,并持續(xù)觀察30min。記錄每只小鼠每5mmin內(nèi)的觸誘發(fā)癢得分情況及30mmin內(nèi)總的得分情況。 3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本研究各組數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,運(yùn)用SPSS13.0版統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。兩組間數(shù)據(jù)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(正態(tài)分布并且方差齊時(shí))或者近似法t’檢驗(yàn)(方差不齊時(shí))；組間多重比較采用單因素方差分析中的Dunnett檢驗(yàn)(正態(tài)分布并且方差齊時(shí))或者Dunnett-T3檢驗(yàn)(方差不齊時(shí))；30mmin內(nèi)每5mmin間的數(shù)據(jù)多重比較采用重復(fù)測(cè)量方差分析中的Bonferroni檢驗(yàn)。P0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 1.CFA炎性皮損區(qū)可引起觸誘發(fā)癢行為 CFA炎癥后第96h,我們采用彎曲力度為1.6mN的von-Frey細(xì)絲輕打在小鼠的炎性皮損區(qū)邊緣,每只小鼠觀察30min,記錄每5min內(nèi)的觸誘發(fā)癢得分及30min內(nèi)的總得分?jǐn)?shù)。結(jié)果顯示CFA炎癥皮損區(qū)可誘發(fā)明顯的觸誘發(fā)癢反應(yīng),其30min內(nèi)總得分為2.6±0.37,而對(duì)照組為0。這種觸誘發(fā)癢反應(yīng)可被納曲酮(naltrexone,1mg/kg)抑制(*P0.05),而對(duì)組胺-1受體(H1R)拮抗劑美吡拉敏(mepyramine,40mg/kg)無(wú)明顯反應(yīng)。說(shuō)明非傷害性刺激可誘發(fā)CFA炎性皮損區(qū)的觸誘發(fā)癢反應(yīng),并且這種觸誘發(fā)癢反應(yīng)是一種非組胺依賴性的搔癢相關(guān)反應(yīng)。 2.B1R和B2R在觸誘發(fā)癢反應(yīng)中的作用 腹腔注射R892(B1R拮抗劑,500ug/kg)可顯著減少CFA炎性皮損區(qū)30min內(nèi)的觸誘發(fā)癢得分(*P0.05),而腹腔注射Hoe140(B2R拮抗劑,300nmol/kg)卻可以顯著增加CFA炎性皮損區(qū)的觸誘發(fā)癢得分(*P0.05)。說(shuō)明B1R可能介導(dǎo)了CFA炎癥小鼠的觸誘發(fā)癢行為,而B(niǎo)2R的作用與之相反。 3. iNOS和NF-κB在觸誘發(fā)癢反應(yīng)中的作用 腹腔注射L-NIL (iNOS抑制劑,5mg/kg),或者PDTC (NF-κB抑制劑,10mg/kg)均可顯著減少CFA炎性皮損區(qū)30min內(nèi)的觸誘發(fā)癢得分(*P0.05)。說(shuō)明NF-κB/iNOS可能參與介導(dǎo)CFA炎性皮損區(qū)的觸誘發(fā)癢反應(yīng)。 全文結(jié)論 1.致痛劑緩激肽可在CFA炎性皮損區(qū)誘發(fā)搔癢反應(yīng),這是一種異常的癢感覺(jué)。 2.非傷害性機(jī)械刺激可在CFA致炎的非搔癢性炎性皮損區(qū)引起觸誘發(fā)癢反應(yīng),這是本研究發(fā)現(xiàn)的一種新的用于研究觸誘發(fā)癢的動(dòng)物模型。 3. CFA炎性皮損區(qū)的觸誘發(fā)癢反應(yīng)和致痛劑緩激肽引起的搔癢反應(yīng)均由B1R介導(dǎo)；而B(niǎo)2R的作用則與之相反,B2R參與抑制這兩種異常癢感覺(jué)的產(chǎn)生。 4. NF-KB/iNOS可能參與介導(dǎo)CFA炎性皮損區(qū)的觸誘發(fā)癢反應(yīng)和緩激肽引起的搔癢反應(yīng)這兩種異常癢感覺(jué)。
【關(guān)鍵詞】：搔癢 緩激肽 完全弗氏佐劑 觸誘發(fā)癢 炎癥
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R758.31
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-19
• 前言19-27
• 第一章 緩激肽受體在致痛劑引起搔癢中的作用27-53
• 1.1 材料與方法28-33
• 1.2 結(jié)果33-46
• 1.3 討論46-52
• 1.4 結(jié)論52-53
• 第二章 緩激肽受體在觸誘發(fā)癢反應(yīng)中的作用53-70
• 2.1 材料與方法54-57
• 2.2 結(jié)果57-64
• 2.3 討論64-69
• 2.4 結(jié)論69-70
• 全文結(jié)論70-72
• 參考文獻(xiàn)72-90
• 英文縮略詞索引表90-93
• 攻讀碩士學(xué)位期間研究成果93-94
• 致謝94-96
• 論文統(tǒng)計(jì)學(xué)評(píng)議96

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

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  本文關(guān)鍵詞：緩激肽受體在炎性皮損區(qū)異常癢感覺(jué)中作用的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

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本文編號(hào)：336492