本文關(guān)鍵詞：山奈酚對小鼠黑色素瘤自殺基因系統(tǒng)的增效作用，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 建立小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞HSV1-tkGFP/GCV自殺基因系統(tǒng),為直觀研究中藥活性成分山奈酚對該自殺基因系統(tǒng)的增效作用的實驗研究打下基礎(chǔ)；證實中藥活性成分山奈酚對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞HSV1-tkGFP/GCV自殺基因系統(tǒng)具有增效作用。 方法： 1.B16細(xì)胞株HSV1-tkGFP/GCV自殺基因系統(tǒng)的建立：首先擴(kuò)增轉(zhuǎn)有質(zhì)粒pLXSN-tkGFP的大腸桿菌,用Ultra Pure QIAGEN Plasmid Midi Kit抽提質(zhì)粒；然后參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書,將重組質(zhì)粒pLXSN-tkGFP和pLXSN-DsRed2分別轉(zhuǎn)染入小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞,經(jīng)過G418篩選、流式分選和有限稀釋法,最終獲得對G418有抗性并且能自發(fā)穩(wěn)定紅綠熒光的單克隆細(xì)胞株,分別命名為B16-tkGFP和B16-RFP。用5μmol/L、50μmol/L和500μmol/LGCV驗證B16-tkGFP細(xì)胞tk基因的表達(dá)。將單克隆細(xì)胞株B16-tkGFP(能穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白GFP)和B16-RFP(能穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白RFP)按不同比例(20%、40%和60%B16-tkGFP)混合,加GCV處理后采用MTT法檢測總細(xì)胞的抑制率；另外在熒光顯微鏡下觀察混合細(xì)胞中B16-tkGFP細(xì)胞和B16-RFP細(xì)胞的變化,特別是未攜帶tk基因的B16-RFP細(xì)胞被殺傷的情況,以評價該重組自殺基因系統(tǒng)HSV1-tkGFP/GCV的自殺效應(yīng)及其旁殺傷效應(yīng)。 2.山奈酚對B16細(xì)胞株HSV1-tkGFP/GCV自殺基因系統(tǒng)的體外增效作用：先用MTT法找到山奈酚不影響B(tài)16細(xì)胞生長的安全濃度和作用時間,再用Di1-Calcein雙染料流式檢測法分析安全濃度范圍內(nèi)的山奈酚對B16細(xì)胞GJIC功能的影響,以以檢測綠色熒光細(xì)胞數(shù)量與熒光雙陰性受體細(xì)胞比值,作為評價GJ功能的指標(biāo)。應(yīng)用MTT法檢測山奈酚聯(lián)合GCV對100%tk+和50%tk+增效的量效關(guān)系,并利用金正均Q值法分析和判斷山奈酚與HSV1-tkGFP/GCV系統(tǒng)聯(lián)合的作用效果；熒光顯微鏡觀察山奈酚對HSV1-tkGFP/GCV系統(tǒng)旁殺傷效應(yīng)的影響。 3.山奈酚對小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞株HSV1-tk/GCV自殺基因系統(tǒng)的體內(nèi)增效作用：將活化的B16-tkGFP細(xì)胞和B16-RFP細(xì)胞按等比例混合后接種于C57BL/6J小黑鼠右腋皮下,待出瘤(接種后第8天)后將其隨機(jī)分為致瘤模型組、GCV50mg/kg組、山奈酚40mg/kg組和山奈酚40mg/kg聯(lián)合GCV50mg/kg組,每組10只小黑鼠,次日起按各給藥組要求每天腹腔注射給藥0.2ml/只,聯(lián)合組的GCV和山奈酚分開給藥,連續(xù)給藥13天；同時致瘤模型組小黑鼠每天相應(yīng)腹腔注射生理鹽水0.2ml/只。在給藥期間,每三天量一次腫瘤大小和稱一次體重,以觀測各組藥物對小黑鼠的體重變化和給藥后的抑瘤效果(n=10)。實驗結(jié)束后解剖取出各組腫瘤、胸腺和脾臟,稱重后用10%中性甲醛固定備用。各組分別取出部分腫瘤組織制作石蠟切片,HE染色后觀察各組腫瘤組織形態(tài)變化。 結(jié)果： 1.將提取的質(zhì)粒pLXSN-tkGFP和質(zhì)粒pLXSN-RFP分別轉(zhuǎn)染入B16細(xì)胞,最終成功篩選出對G418具有抗性的單克隆細(xì)胞株B16-tkGFP(能自發(fā)穩(wěn)定的綠色熒光)和單克隆細(xì)胞株B16-RFP (能自發(fā)穩(wěn)定的紅色熒光)；經(jīng)GCV殺傷實驗證實了轉(zhuǎn)入的tk基因在B16-tkGFP細(xì)胞中能正常穩(wěn)定地表達(dá)。B16-tkGFP細(xì)胞和B16-RFP細(xì)胞的混合細(xì)胞共培養(yǎng)實驗中,MTT檢測結(jié)果及熒光顯微觀察圖片表明了該重組自殺基因系統(tǒng)具有一定的旁殺傷效應(yīng)(P0.01)。 2.0μimol/L～12μmol/L山奈酚作用48h對B16生長增殖沒有影響,熒光傳遞實驗中用0μmol/L、3μmol/L、6μmol/L和12μmol/L山奈酚處理B16細(xì)胞48h后,綠色熒光細(xì)胞(凡)與雙陰性受體細(xì)胞(A3)的比值(A4/A3)分別為0.056±0.006、0.072±0.013、0.079±0.009和0.094±0.013。3μmol/L山奈酚聯(lián)合3μmol/L、6μmol/L和12μmol/L的GCV對100%B16-tkGFP細(xì)胞作用72h可表現(xiàn)出協(xié)同增效作用；6.25μmol/LGCV聯(lián)合6.25μmol/L和12.5μmol/L的山奈酚對100%B16-tkGFP細(xì)胞作用96h也可表現(xiàn)出協(xié)同增效作用；濃度為6.25μmol/L的山奈酚聯(lián)合6.25μmol/L的GCV對含50%B16-tkGFP的混合細(xì)胞作用96h能表現(xiàn)出協(xié)同增效作用。熒光圖片也顯示3μmol/L、6μmol/L和12μmol/L山奈酚聯(lián)合40μmol/LGCV對50%B16-tkGFP作用72h表現(xiàn)出明顯的“旁觀者效應(yīng)”,并且隨著聯(lián)合組山奈酚濃度的增加,旁殺傷效應(yīng)逐漸顯著。 3.含50%B16-tkGFP混合細(xì)胞致瘤的動物實驗結(jié)果顯示GCV聯(lián)合山奈酚組的腫瘤增長倍數(shù)小于單獨GCV組(P0.05),蘇木素-伊紅染色結(jié)果顯示GCV組和山奈酚聯(lián)合GCV組腫瘤細(xì)胞密度均較模型組低；并且表現(xiàn)出較模型組和GCV組更明顯的炎癥淋巴細(xì)胞浸潤現(xiàn)象；山奈酚聯(lián)合GCV組更明顯。而以上現(xiàn)象,GCV聯(lián)合山奈酚組比GCV組更明顯。 結(jié)論： 山奈酚對HSV1-tkGFP/GCV自殺基因系統(tǒng)治療小鼠黑色素瘤具有一定增效作用,且有可能是通過增強(qiáng)細(xì)胞的GJIC功能來實現(xiàn)的,體內(nèi)實驗可能與山奈酚調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能有一定關(guān)系,但具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。
【關(guān)鍵詞】：自殺基因系統(tǒng) 旁觀者效應(yīng) 縫隙連接通訊 黑色素瘤 山奈酚
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 第一章 文獻(xiàn)研究13-23
• 第一節(jié) 腫瘤自殺基因治療的研究進(jìn)展13-20
• 一、腫瘤基因治療的研究進(jìn)展13-15
• 二、腫瘤自殺基因療法的研究概述15-17
• 三、GJIC與自殺基因系統(tǒng)的旁殺傷效應(yīng)17-18
• 四、自殺基因療法在治療黑色素瘤方面的研究18-20
• 第二節(jié) 山奈酚藥理作用研究進(jìn)展20-23
• 一、山奈酚的概述20
• 二、山奈酚在抗腫瘤方面的研究20-23
• 第二章 實驗研究23-55
• 第一節(jié) B16細(xì)胞株HSV1-tkGFP/GCV自殺基因系統(tǒng)的建立23-32
• 一、質(zhì)粒的擴(kuò)增和提取23-25
• 二、重組自殺基因系統(tǒng)的建立和鑒定25-30
• 三、實驗討論30-32
• 第二節(jié) 山奈酚對B16細(xì)胞株HSV1-tkGFP/GCV系統(tǒng)的體外增效作用32-45
• 一、山奈酚對B16細(xì)胞株縫隙連接功能的影響初探32-37
• 二、山奈酚對B16細(xì)胞株HSV1-tkGFP/GCV系統(tǒng)的增效作用37-43
• 三、實驗討論43-45
• 第三節(jié) 山奈酚對B16細(xì)胞株HSV1-tk/GCV系統(tǒng)的體內(nèi)增效作用45-55
• 一、體內(nèi)山奈酚對HSV1-tk/GCV系統(tǒng)治療小鼠黑色素瘤的影響45-51
• 二、HE染色法觀察山奈酚增效實驗各組腫瘤組織變化51-53
• 三、實驗討論53-55
• 第三章 結(jié)語55-59
• 參考文獻(xiàn)59-65
• 附錄65-79
• 附錄Ⅰ：英文縮略語65-67
• 附錄Ⅱ：HSV1-tkGFP/GCV系統(tǒng)旁殺傷效應(yīng)驗證結(jié)果67-71
• 附錄Ⅲ：山奈酚增強(qiáng)HSV1-tk/GCV系統(tǒng)旁殺傷效應(yīng)的結(jié)果71-75
• 附錄Ⅳ：動物實驗?zāi)[瘤病理組織學(xué)檢查結(jié)果(HE染色法)75-79
• 在校期間發(fā)表的論文79-80
• 致謝80

【參考文獻(xiàn)】

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  本文關(guān)鍵詞：山奈酚對小鼠黑色素瘤自殺基因系統(tǒng)的增效作用，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號：319636