發(fā)布時間：2021-04-05 06:28

　　皮膚惡性黑素瘤是惡性程度較高的腫瘤之一，易于侵襲和轉(zhuǎn)移。近年來發(fā)現(xiàn)，BRAF基因在人黑素瘤中存在高頻率的突變，目前對其在黑素瘤形成、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用尚不完全明確。本課題的目的是通過質(zhì)粒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù)來研究BRAF突變基因在黑素瘤發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用。首先，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將3條構(gòu)建并鑒定好的質(zhì)粒載體(braf1、braf2和neg，其中braf1和braf2分別特異性針對人黑素瘤BRAF^V600E突變基因和BRAF基因，neg為陰性對照)轉(zhuǎn)入黑素瘤細(xì)胞系A(chǔ)375細(xì)胞，并用含G418的培養(yǎng)液篩選陽性克隆。然后采用半定量RT-PCR和Westernblotting檢測shRNA對BRAF基因的抑制作用。發(fā)現(xiàn)兩個特異性質(zhì)粒不同程度抑制BRAF基因的mRNA和蛋白的表達(dá)，其中以braf1的干擾效果最為明顯，蛋白表達(dá)量下降90％。第二，我們將等量轉(zhuǎn)入質(zhì)粒（braf1和neg）及未轉(zhuǎn)入質(zhì)粒的腫瘤細(xì)胞，分別注入裸鼠皮下，觀察干擾BRAF^V600E后，腫瘤細(xì)胞的成瘤情況，結(jié)果顯示braf1質(zhì)粒組腫瘤較其它組生長緩慢，瘤體重量較輕。在另一個動物實驗... 

【文章來源】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院北京市 211工程院校 985工程院校

【文章頁數(shù)】：70 頁

【學(xué)位級別】：博士

【文章目錄】：
縮略語
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 shRNA對人黑素瘤細(xì)胞BRAF基因沉默作用的體內(nèi)外研究
    第一節(jié) 實驗試劑及儀器
        一、主要試劑及溶液的配置
        二、主要儀器及耗材
    第二節(jié) 實驗方法
        一、特異性發(fā)卡狀shRNA編碼序列的設(shè)計、合成、篩選、純化、鑒定和測序
        二、質(zhì)粒擴(kuò)增和抽提
        三、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        四、抗性克隆的篩選
        五、裸鼠成瘤實驗
        六、荷瘤裸鼠治療實驗
        七、半定量RT-PCR
        八、Western blotting
    第三節(jié) 結(jié)果
        一、質(zhì)粒體外轉(zhuǎn)染效率
        二、裸鼠成瘤試驗
        三、荷瘤鼠治療試驗
        四、蛋白定量
        五、shRNA在體外對A375細(xì)胞BRAF基因mRNA和蛋白表達(dá)的抑制效果
        六、裸鼠瘤體中BRAF基因mRNA和蛋白表達(dá)
    第四節(jié) 討論
        一、siRNA導(dǎo)入細(xì)胞和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選
        二、干擾后BRAF基因的表達(dá)
    參考文獻(xiàn)
第二部分 干擾BRAFV599E突變基因?qū)θ撕谒亓黾?xì)胞體內(nèi)外侵襲作用的影響機(jī)制初探
    第一節(jié) 實驗試劑及儀器
        一、主要試劑及溶液的配置
        二、主要儀器及耗材
    第二節(jié) 實驗方法
        一、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
        二、Transwell小室體外侵襲試驗
        三、明膠酶譜
        四、腫瘤體內(nèi)轉(zhuǎn)移實驗
        五、半定量RT-PCR
        六、Western blotting
    第三節(jié) 結(jié)果
        一、Transwell小室體外侵襲試驗
        二、干擾BRAF基因?qū)δ[瘤的明膠酶酶活性的影響
        三、干擾BRAF基因?qū)δ[瘤MMP-2和VEGFmRNA和蛋白體內(nèi)外表達(dá)的影響
        四、干擾BRAF基因?qū)δ[瘤細(xì)胞體內(nèi)轉(zhuǎn)移能力的影響
    第四節(jié) 討論
參考文獻(xiàn)
全文小結(jié)
論文相關(guān)綜述
博士期間發(fā)表文章及參加學(xué)術(shù)活動情況
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]短發(fā)卡RNA對人黑素瘤細(xì)胞BRAF基因的沉默作用[J]. 韓永智,孫建方,周武慶,曾學(xué)思,姜祎群.  中華皮膚科雜志. 2006(11)
[2]西安、重慶兩所醫(yī)院20年皮膚惡性黑素瘤回顧[J]. 孫東杰,高天文,李春英,劉榮卿,李青,劉友生,刁慶春,何弘,黃高升,郝飛,馬福成,柳鳳軒,鐘白玉,閆小初,劉東梅,李廷慧,劉玉峰.  中華皮膚科雜志. 2004(02)



本文編號：3119315