目的:探討小干擾RNA（siRNA）抑制p21表達(dá)對(duì)低濃度過(guò)氧化氫（H₂O₂）誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞提前衰老的影響,以及黑素細(xì)胞提前衰老與黑素傳遞功能間的關(guān)系。方法:p21 siRNA序列轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞,采用熒光顯微鏡、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）及western blot檢測(cè)抑制效率。將正常人黑素細(xì)胞分為對(duì)照組（陰性siRNA轉(zhuǎn)染處理）、p21 siRNA組（p21 siRNA轉(zhuǎn)染處理）、陰性siRNA+H₂O₂組（陰性siRNA轉(zhuǎn)染24 h后加入400μmol/L H₂O₂處理）及p21 siRNA+H₂O₂組（p21 siRNA轉(zhuǎn)染24 h后加入400μmol/L H₂O₂處理）。采用β-半乳糖苷酶染色檢測(cè)細(xì)胞衰老;EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)細(xì)胞增殖能力;western blot檢測(cè)各組p21和樹突調(diào)節(jié)蛋白[RhoA、Rac1及細(xì)胞分裂周期蛋白42（Cdc42）]表... 

【文章來(lái)源】：臨床皮膚科雜志. 2020,49(06)北大核心

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【部分圖文】：

黑素細(xì)胞經(jīng)p21 siRNA干擾后轉(zhuǎn)染效率（×40)

EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果示p21 siRNA組黑素細(xì)胞EdU陽(yáng)性細(xì)胞百分率[（20.60±0.56）%]較對(duì)照組[（18.68±0.16）%]增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。H2O2處理后，陰性siRNA+H2O2組黑素細(xì)胞增殖能力[（9.60±0.35）%]較對(duì)照組明顯降低（P<0.05);p21 siRNA+H2O2組[（14.37±0.65）%]與陰性siRNA+H2O2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）（圖3C）。提示p21 siRNA預(yù)處理可改善H2O2誘導(dǎo)的黑素細(xì)胞增殖能力降低。2.5 各組RhoA、Rac1及Cdc42蛋白表達(dá)水平比較

越來(lái)越多的研究表明，氧化應(yīng)激在白癜風(fēng)發(fā)病中起關(guān)鍵作用[1,12]。許多與氧化應(yīng)激相關(guān)的進(jìn)行性或非進(jìn)行性慢性病變被稱為退行性疾病，這些疾病的病理已被證明是由持續(xù)的亞致死性氧化應(yīng)激刺激，最終導(dǎo)致衰老和細(xì)胞退化[13]。因此推測(cè)持續(xù)的氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞發(fā)生類似情況，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)黑素細(xì)胞衰老和退化。本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，持續(xù)低濃度亞致死性（400μmol/L)H2O2誘導(dǎo)黑素細(xì)胞提前衰老，且刺激黑素細(xì)胞提前衰老的H2O2濃度在白癜風(fēng)皮損中H2O2升高的水平范圍內(nèi)（最高10-3 mol/L)[14]。上述證據(jù)支持白癜風(fēng)可能是一種退行性疾病。因此，本研究推測(cè)在白癜風(fēng)發(fā)病的早期階段，H2O2可能不足以殺死黑素細(xì)胞，但通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，干擾其活力和功能[15]。衰老細(xì)胞通常表現(xiàn)為β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性率增加，細(xì)胞增殖能力降低和衰老相關(guān)蛋白表達(dá)水平上調(diào)（p16、p53及p21)[16]。本研究的前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)低濃度H2O2處理黑素細(xì)胞可以經(jīng)p53/p21途徑誘導(dǎo)黑素細(xì)胞提前衰老。本研究通過(guò)干擾p21表達(dá)，抑制細(xì)胞衰老，經(jīng)p21 siRNA處理，再由H2O2刺激后，與陰性siRNA+H2O2組比較，p21 siRNA+H2O2組β-半乳糖苷酶染色細(xì)胞陽(yáng)性率降低、細(xì)胞增殖能力升高及衰老相關(guān)蛋白p21表達(dá)降低。提示通過(guò)轉(zhuǎn)染抑制p21表達(dá)，可以改善H2O2處理后黑素細(xì)胞的提前衰老。黑素細(xì)胞在黑素小體中合成黑素，并通過(guò)細(xì)胞骨架將黑素轉(zhuǎn)運(yùn)至樹突末端，隨后將其轉(zhuǎn)移至周圍的角質(zhì)形成細(xì)胞中[17-18]。黑素細(xì)胞-角質(zhì)形成細(xì)胞的黑素轉(zhuǎn)移是色素沉著的重要過(guò)程。黑素細(xì)胞在表皮細(xì)胞中占少數(shù)，需與周圍角質(zhì)形成細(xì)胞相互接觸，因此黑素小體傳遞需要樹突的延伸，從而實(shí)現(xiàn)有效的黑素轉(zhuǎn)移[3]。黑素小體遷移過(guò)程中，黑素細(xì)胞樹突向周圍的角質(zhì)形成細(xì)胞延伸，將黑素小體傳遞至角質(zhì)形成細(xì)胞中。這種形態(tài)變化，與肌動(dòng)蛋白和微管重組有關(guān)[19]。許多因素調(diào)節(jié)樹突形態(tài)和細(xì)胞骨架成分（如肌動(dòng)蛋白和微管），關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子包括Rho家族蛋白，Rho家族的小GTP酶調(diào)節(jié)許多細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞極性、胞吞作用、囊泡運(yùn)輸、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、分化和基因轉(zhuǎn)錄[20]。其中3個(gè)小GTP酶發(fā)揮關(guān)鍵作用，包括RhoA、Rac1和Cdc42。已有研究確定RhoA誘導(dǎo)樹突回縮和應(yīng)力纖維形成[21],Rac1介導(dǎo)樹突和板狀偽足形成[22-24],Cdc42誘導(dǎo)絲狀偽足和肌動(dòng)蛋白微突形成[4,25]。另一方面，在神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)源性細(xì)胞中（包括黑素細(xì)胞在內(nèi)），RhoA刺激樹突回縮，Rac1促進(jìn)樹突生長(zhǎng)和延伸，Cdc42介導(dǎo)樹突形成[26]。有研究報(bào)道皮損處黑素細(xì)胞樹突回縮和數(shù)目減少[27]。活動(dòng)期白癜風(fēng)患者皮損邊緣黑素細(xì)胞和周圍角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的黑素小體計(jì)數(shù)顯著下降[5]。因此，推測(cè)低濃度H2O2誘導(dǎo)黑素細(xì)胞提前衰老，損傷黑素細(xì)胞傳遞黑素小體的功能，參與白癜風(fēng)發(fā)病。本研究中通過(guò)western blot檢測(cè)樹突關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子———RhoA、Rac1和Cdc42的表達(dá)，研究低濃度H2O2對(duì)黑素傳遞的影響，發(fā)現(xiàn)低濃度H2O2處理黑素細(xì)胞誘導(dǎo)樹突負(fù)性調(diào)節(jié)因子RhoA表達(dá)增高，正性調(diào)節(jié)因子Rac1和Cdc42表達(dá)降低。采用免疫熒光檢測(cè)H2O2處理前后細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和黑素小體分布變化，發(fā)現(xiàn)H2O2處理后，細(xì)胞骨架F-actin熒光強(qiáng)度減弱及細(xì)胞樹突縮短，黑素小體分布集中于胞核周圍，樹突末端分布減少。以上結(jié)果均表明，H2O2處理黑素細(xì)胞抑制樹突形成和延伸，從而抑制黑素小體轉(zhuǎn)移。為了進(jìn)一步探討黑素細(xì)胞提前衰老與黑素傳遞功能間的關(guān)系，本研究應(yīng)用siRNA p21小干擾序列轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞，抑制p21表達(dá)，抑制黑素細(xì)胞提前衰老，結(jié)果示p21 siRNA+H2O2組與陰性siRNA+H2O2組比較，RhoA表達(dá)降低，Rac1和Cdc42表達(dá)增高；免疫熒光示樹突延長(zhǎng)及樹突黑素小體分布增多，提示H2O2誘導(dǎo)提前衰老的黑素細(xì)胞存在黑素小體傳遞功能障礙，黑素小體轉(zhuǎn)移至周圍的角質(zhì)形成細(xì)胞減少，從而引起色素脫失。

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]低濃度過(guò)氧化氫誘導(dǎo)人黑素細(xì)胞提早衰老[J]. 孫利,石家綺,丁書紅,熊喜喜,李雪,魯嚴(yán).  南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版). 2018(02)
[2]人表皮黑素細(xì)胞與角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)體外模型中黑素小體轉(zhuǎn)運(yùn)的觀察[J]. 解士海,陳志強(qiáng),馬鵬程,卜今,周武慶,崔盤根,高建明,李玲珺,范衛(wèi)新.  臨床皮膚科雜志. 2006(05)
[3]白癜風(fēng)皮損黑素細(xì)胞HMB-45、酪氨酸酶及其相關(guān)蛋白1的免疫組化研究[J]. 譚城,朱文元,魯嚴(yán).  臨床皮膚科雜志. 2003(07)



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