本課題研究包含了三個分子克隆系統(tǒng)改建的技術(shù)性課題,兩個黑色素瘤基因治療的課題和一個黑色素瘤全基因組耐藥基因篩查的課題,這三個課題同時也是三個技術(shù)課題成果的應(yīng)用和進(jìn)一步證明。此外還在課題組原有的黑色素母細(xì)胞可逆性永生化的研究基礎(chǔ)上進(jìn)行了SV40-T抗原對黑色素母細(xì)胞永生化重編程的研究。各個部分課題相對獨(dú)立完整又相互關(guān)聯(lián)。Daniel Gibson開發(fā)的Gibson DNA Assembly是一種基于雙鏈DNA分子同源序列進(jìn)行無縫拼接的DNA連接方式,相較于傳統(tǒng)的基于內(nèi)切酶位點(diǎn)的分子克隆連接方式有其獨(dú)特的優(yōu)勢。本研究基于DNA Gibson Assembly法,突破以往分子克隆的多種局限性,進(jìn)行了三種分子克隆技術(shù)的革新：一、發(fā)明了無需重組的腺病毒構(gòu)建系統(tǒng)；二、創(chuàng)建了多段干擾序列一步合成共表達(dá)的siRNA表達(dá)系統(tǒng)；三、建成了低成本,全基因組覆蓋,簡便易行,隨機(jī)無偏性的siRNA文庫。本課題組在黑色素細(xì)胞的干細(xì)胞生物學(xué),腫瘤生物學(xué)方面有多年的研究積累。技術(shù)的開發(fā)是為了應(yīng)用,上述分子克隆表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建完成后,我們將這些技術(shù)探索性地用于黑色素瘤基因治療和耐藥靶點(diǎn)篩查的研究,一方面在科研實(shí)踐中驗(yàn)證所革... 

【文章來源】：中國人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)重慶市

【文章頁數(shù)】：121 頁

【學(xué)位級別】：博士

【部分圖文】：

圖３－Ｌ?ｉｍｃ２３和ｉｍｃｐｏｏｌ細(xì)胞裸鼠在體皮內(nèi)移植２周生成增生物??

Ｉｍｃｘ＋ＡｄＦｌｉｐ?４１０６６５３??圖３－１８．?ｐ５３巧光報告結(jié)巧分析ｉｍｃｘ去除ＳＶ４０－Ｔ前６?ｐ５３的表達(dá)變化??Ｏｖｅｒ?ｅｘｐｒｅｓｓ?ｔｈｅ?ｆｏｕｒ?

ＳＶ４０－Ｔ黑色素譜系細(xì)胞的干細(xì)胞生物學(xué)研究主要依賴轉(zhuǎn)基因動物模型和器官培養(yǎng)，一直??缺乏穩(wěn)定的細(xì)胞模型，原因在于黑色素母細(xì)胞或干細(xì)胞原代分離純化和體外培養(yǎng)比較??困難。細(xì)胞永生化技術(shù)是克服原代培養(yǎng)困難建立穩(wěn)定細(xì)胞株的常用方法。ＳＶ４０－Ｔ抗??原是常用的永生化外源基因。本實(shí)驗(yàn)室長期從事黑色素譜系細(xì)胞的研究，之前成功分??離原代的黑色素母細(xì)胞，可逆性導(dǎo)入ＳＶ４０－Ｔ抗原，建立了便于傳代擴(kuò)增的黑素母細(xì)??胞株ｉｍｃ２３，ｉｍｃｐｏｏｌ等，相關(guān)成果已發(fā)表（Ｃｏｎ航化加’ｏｎ仿ｔｏ地Ａｅｎｋ片ｅｓ??ａ?民ｅｐｅｒｔｏｉｒｅ?ｏｆ?Ｍｏｕｓｅ?Ｍｅｌａｎｏｃｙｔｅ?Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ?ｗｉｔｈ?Ｄｉｓｔｉｎｃｔ?Ｍｄ幻ｎｏｇｅｎｉｃ?Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ??Ｐｏ?化?ｎｔｉａ�。�?Ｊｏｕｍａ！?ｏｆ?Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ?Ｄｅｒｍａ?化?ｌｏｇｙ?１３２?（１０）?：?２４?７９－２４８３?）。??本實(shí)驗(yàn)在對該細(xì)胞株的生物學(xué)性狀進(jìn)行進(jìn)一步檢測，探討ＳＶ４０－Ｔ抗原永生化黑??素母細(xì)胞的可行性，安全性及具體機(jī)制時，發(fā)現(xiàn)了非常有趣的現(xiàn)象，即經(jīng)ＳＶ４０－Ｔ抗??原永生化后的黑素母細(xì)胞能在體形成類似疇胎瘤的組織塊，提示ＳＶ４０－Ｔ抗原可能對??黑素母細(xì)胞具有重編程的作用。??

【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]β-catenin與小鼠毛囊衰老性變化相關(guān)[J]. 鄧芳,郭海英,支軼,連小華,楊恬.  基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床. 2012(10)



本文編號：3044567