發(fā)布時(shí)間：2020-11-20 21:38

　　 背景白癜風(fēng)是一種常見的以皮膚黑素細(xì)胞破壞為特征的色素脫失性疾病,該病發(fā)病機(jī)制尚不明確。近年來研究表明:氧化應(yīng)激誘導(dǎo)所致的凋亡可能在表皮黑素細(xì)胞損傷中起到起始作用,凋亡的黑素細(xì)胞蛋白具有免疫源性,可以誘導(dǎo)針對(duì)自身抗原的免疫應(yīng)答,繼而造成黑素細(xì)胞免疫損傷,加劇黑素細(xì)胞破壞,導(dǎo)致白癜風(fēng)的發(fā)生。另外,白癜風(fēng)皮損周可見細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic lymphocyte,CTL)浸潤(rùn),可靶向殺傷黑素細(xì)胞,且白癜風(fēng)患者血液中含有針對(duì)黑素細(xì)胞的特異性抗體,以上證據(jù)提示細(xì)胞、體液免疫應(yīng)答是黑素細(xì)胞破壞的主要效應(yīng)環(huán)節(jié)。前期諸多研究明確了特異性免疫應(yīng)答所識(shí)別的白癜風(fēng)相關(guān)抗原,但胞內(nèi)抗原的暴露、識(shí)別、吞噬的分子機(jī)制尚不明確。凋亡小體(Apoptotic Bodies,ABs)的功能近年來逐漸被人們所關(guān)注,研究表明ABs包含自身免疫相關(guān)蛋白,主要包括熱休克蛋白,組蛋白,表面蛋白烯醇化酶(Enolase)等。同時(shí)紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)相關(guān)研究也表明自身抗原在細(xì)胞凋亡過程中逐漸向細(xì)胞表面富集,抗原組分通過膜出泡的形式再定位于ABs,ABs進(jìn)一步被周圍的吞噬細(xì)胞或非專職呈遞細(xì)胞所吞噬,形成自身抗原的免疫呈遞,誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在胰島素瘤來源的間充質(zhì)干細(xì)胞研究中,細(xì)胞外囊泡包含有自身抗原及免疫佐劑,可誘導(dǎo)T細(xì)胞應(yīng)答。另外,Buzas等人研究發(fā)現(xiàn),在應(yīng)激及損傷等條件下,細(xì)胞釋放ABs,內(nèi)含損傷相關(guān)分子模式(Damage-associated molecular patterns,DAMPs),可以誘導(dǎo)及維持炎癥的發(fā)生和發(fā)展。這些研究提示,ABs是自身抗原及危險(xiǎn)信號(hào)的重要載體,在自身免疫疾病中起著關(guān)鍵作用。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)我們的白癜風(fēng)研究帶來了新的思考與探索,即氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞是否也形成ABs,是否也包含相關(guān)自身抗原,是否也參與了白癜風(fēng)的發(fā)生發(fā)展,ABs是否能成為連接氧化應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡與免疫介導(dǎo)黑素細(xì)胞破壞之間的橋梁?基于文獻(xiàn)回顧和課題組以往研究,針對(duì)上述疑問,我們提出如下假設(shè):氧化應(yīng)激通過激活JNK、caspase等凋亡信號(hào)通路,啟動(dòng)自身抗原成分形成ABs,促進(jìn)活化的表朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cell,LC)識(shí)別、吞噬ABs,最終誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答發(fā)生,促進(jìn)白癜風(fēng)發(fā)展。方法本研究使用白癜風(fēng)永生化黑素細(xì)胞系(PIG3V),利用氧化應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡,分離純化ABs,透射電鏡形態(tài)學(xué)鑒定ABs,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)微粒表面磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine,PS)的表達(dá),進(jìn)一步鑒定ABs質(zhì)量,Western Blot鑒定ABs中相關(guān)抗原組分,蛋白質(zhì)組學(xué)驗(yàn)證Western Blot結(jié)果,免疫電鏡觀察抗原與ABs共定位情況。觀察不同氧化應(yīng)激條件下ABs的形態(tài)學(xué)改變,Western Blot檢測(cè)ABs中抗原再定位情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ABs的形成情況(FSC/SSC分析),分析自身抗原表達(dá)量、ABs形成與氧化應(yīng)激誘導(dǎo)時(shí)間、劑量是否存在正相關(guān),探討自身抗原、ABs形成以及氧化應(yīng)激之間的關(guān)聯(lián)性;在穩(wěn)定的凋亡模型的基礎(chǔ)上,利用JNK、caspase、骨架蛋白激活等激酶抑制劑預(yù)處理PIG3V細(xì)胞,Western Blot檢測(cè)ABs中抗原蛋白量的變化,流式檢測(cè)ABs形成的變化,觀察相關(guān)信號(hào)通路激酶抑制劑對(duì)ABs形成及抗原再定位的影響,明確參與ABs形成的信號(hào)通路。結(jié)果1.選擇由低到高濃度的H2O2,處理黑素細(xì)胞24h后檢測(cè)細(xì)胞的凋亡情況并做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,明確造成凋亡有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義而壞死無明顯差異的濃度800μmol/l,成功建立黑素細(xì)胞凋亡模型。2.分離純化ABs,進(jìn)行電鏡形態(tài)學(xué)鑒定,進(jìn)一步流式鑒定表面PS表達(dá)明確90%以上被檢顆粒為Annexin V陽性,提示我們成功分離純化了ABs。3.選取已經(jīng)明確的白癜風(fēng)相關(guān)抗原蛋白抗體TYR,TYRP-1,TYRP-2及我們課題組前期發(fā)現(xiàn)的Lamin A及Lamin A(ASP230)等進(jìn)行ABs總蛋白的Western Blot實(shí)驗(yàn),明確了Lamin A(ASP230),TYRP-1在凋亡過程中可再定位于ABs。進(jìn)一步研究明確胞質(zhì)及核內(nèi)自身免疫性相關(guān)抗原蛋白也可在凋亡過程中再定位于ABs。蛋白質(zhì)組學(xué)證實(shí)了Western Blot結(jié)果。免疫電鏡的方法觀察到了陽性抗原與ABs存在共定位。4.對(duì)黑素細(xì)胞進(jìn)行不同強(qiáng)度及不同時(shí)間的氧化應(yīng)激刺激,電鏡形態(tài)學(xué)鑒定ABs,發(fā)現(xiàn)隨著刺激濃度增加,ABs形態(tài)無明顯改變,但接近壞死濃度時(shí),ABs較少,大部分為壞死細(xì)胞碎片。進(jìn)一步觀察不同時(shí)間ABs變化,發(fā)現(xiàn)隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng),ABs逐漸腫脹,破碎。5.對(duì)黑素細(xì)胞進(jìn)行不同強(qiáng)度及不同時(shí)間的氧化應(yīng)激刺激,Western Blot發(fā)現(xiàn)ABs中陽性抗原蛋白與氧化應(yīng)激刺激強(qiáng)度及時(shí)間呈正相關(guān)。進(jìn)一步流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ABs形成情況,發(fā)現(xiàn)ABs形成與氧化應(yīng)激刺激強(qiáng)度和時(shí)間呈正相關(guān)。6.利用JNK抑制劑SP600125、caspase抑制劑Z-VAD、骨架蛋白激活激酶抑制劑Y-27632及ML-9預(yù)處理細(xì)胞后誘導(dǎo)凋亡,分離純化ABs,Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抑制相關(guān)信號(hào)通路可以抑制陽性抗原再定位于ABs,流式檢測(cè)ABs的形成,發(fā)現(xiàn)抑制相關(guān)信號(hào)通路可以抑制ABs的形成,以上結(jié)果提示:JNK、caspase、骨架蛋白激活相關(guān)信號(hào)通路參與抗原再定位及ABs形成。結(jié)論本研究成功分離純化了PIG3V細(xì)胞來源的ABs,鑒定明確ABs含有Lamin A(ASP230)、TYRP-1等白癜風(fēng)相關(guān)抗原蛋白,JNK、caspase、骨架蛋白激活等信號(hào)通路參與ABs形成及抗原再定位。綜合文獻(xiàn)及我們研究結(jié)果提示,氧化應(yīng)激通過激活JNK信號(hào)通路啟動(dòng)caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)凋亡,白癜風(fēng)相關(guān)抗原參與形成ABs。高強(qiáng)度及長(zhǎng)時(shí)間氧化應(yīng)激條件下ABs膜完整性受損,抗原蛋白可由ABs釋放至膜外,提示ABs可能為胞內(nèi)抗原直接外泄的途徑。綜上所述,本研究首次明確了在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)黑素細(xì)胞凋亡后自身抗原變形凝集于ABs,胞內(nèi)抗原暴露,為特異性CTL克隆及活化自反應(yīng)性B細(xì)胞提供了可能的抗原來源,為氧化應(yīng)激啟動(dòng)自身免疫反應(yīng)的機(jī)制提供了新證據(jù),對(duì)于進(jìn)一步豐富和完善白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制提供了重要的理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2015
【中圖分類】：R758.41
【部分圖文】：

圖 1 遺傳、環(huán)境與免疫因素共同作用導(dǎo)致白癜風(fēng)發(fā)病化應(yīng)激啟動(dòng)黑素細(xì)胞凋亡癜風(fēng)氧化-抗氧化失衡究表明在白癜風(fēng)發(fā)病早期，外源性持續(xù)氧化應(yīng)激因子是誘發(fā)白斑的重VB、酚類接觸物、外傷等，這也與臨床上白癜風(fēng)常見于面頸、肢端等致[22]。諸多證據(jù)表明白癜風(fēng)患者血清或表皮局部微環(huán)境中存在著氧化衡紊亂。首先在患者皮損局部發(fā)現(xiàn)了 H2O2過量蓄積，濃度高達(dá) 103/如丙二醛也明顯升高[23-25]。 總抗氧化狀態(tài)及抗氧化物谷胱甘肽過氧氫酶等抗氧化酶活性也明顯下降[26,27]。另外，白癜風(fēng)患者紅細(xì)胞中脂及超氧化物歧化酶活性顯著升高，谷胱甘肽過氧化物酶活性、谷胱甘低，黃嘌呤氧化酶活性、血漿丙二醛（Malondialdehyde ，MDA）也常情況下表皮黑素細(xì)胞在合成黑素小體的過程中會(huì)導(dǎo)致胞漿內(nèi)過量

4 目前尚存在的問題前期研究結(jié)果和文獻(xiàn)支持，氧化應(yīng)激和自身免疫共同參與了白癜風(fēng)的發(fā)病，凋亡后所啟動(dòng)的自身免疫應(yīng)答可能是白癜風(fēng)急速發(fā)展、進(jìn)一步惡化的主要原因。細(xì)胞、體液免疫應(yīng)答是黑素細(xì)胞破壞的主要效應(yīng)環(huán)節(jié)，特異性免疫應(yīng)答所識(shí)別黑素細(xì)胞抗原已明確，但胞內(nèi)自身抗原暴露、識(shí)別、吞噬的分子機(jī)制尚不明確。這些自身抗原如何暴露，如何被表皮 LC 細(xì)胞吞噬、呈遞，如何啟動(dòng)細(xì)胞免疫及體液免疫應(yīng)答，自然成為我們下一步關(guān)注的重點(diǎn)。我們推測(cè)，黑素細(xì)胞凋亡清除機(jī)制異常，胞內(nèi)自身抗原釋放，是抗原暴露、抗原呈遞的重要效應(yīng)環(huán)節(jié)。結(jié)合大量文獻(xiàn)及前期研究結(jié)果，我們提出本課題研究假說（圖 2）：在黑素細(xì)胞的凋亡過程中，氧化應(yīng)激通過激活 JNK、caspase 等凋亡信號(hào)通路、剪切 Lamin A等凋亡途徑，促進(jìn)自身抗原形成 ABs，晚期凋亡黑素細(xì)胞釋放出危險(xiǎn)信號(hào) DangerSignals ，促進(jìn)活化表皮 LC 細(xì)胞識(shí)別、吞噬 ABs，誘導(dǎo)特異性免疫應(yīng)答。

圖 3 不同濃度 H2O2刺激 PIG3V 凋亡分析細(xì)胞刺激 24h 后染 Annexin V 和 PI，由流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡，可見凋亡及壞隨著刺激濃度升高而逐漸升高。1.2 統(tǒng)計(jì)篩選刺激濃度我們發(fā)現(xiàn)由于 PIG3V 細(xì)胞本身作為一種受損細(xì)胞，其刺激濃度過高，會(huì)對(duì)后驗(yàn)造成影響，ABs 的釋放在早期凋亡和晚期凋亡中都是存在的，并且其發(fā)生晚 外翻，因此，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（圖 4），綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)，我們選擇有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異而壞死無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的刺激濃度做為實(shí)驗(yàn)濃度(800μmol/L)。
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本文編號(hào)：2892028