銀屑病是多基因遺傳背景和環(huán)境等多因素作用下的T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病,嚴(yán)重影響患者的身心健康和工作生活。近幾年來,腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)又稱為Apo2L ,TRAIL在皮膚增生、凋亡、炎癥、免疫等疾病中的研究已成為皮膚藥理學(xué)的研究熱點。皮膚是過敏和炎癥的頻發(fā)部位,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等參與了反應(yīng),TRAIL與皮膚細(xì)胞的增生、分化密切相關(guān),在調(diào)節(jié)皮膚炎癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用,維持了皮膚內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。TRAIL在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的重要作用并探索將其作為治療新的銀屑病藥物作用靶點的可行性研究,將為有效治療銀屑病尋求療效好、復(fù)發(fā)率低的新藥提供理論依據(jù)。為人類攻克銀屑病開辟新的研究領(lǐng)域和提供新的研究思路。 本研究首先建立了用于檢測TRAIL蛋白表達(dá)的免疫組化和Realtime PCR方法,考察了銀屑病皮損、健康人皮膚、成纖維細(xì)胞中TRAIL的表達(dá)特點。研究芥子氣誘導(dǎo)真皮成纖維細(xì)胞的凋亡及其機(jī)制。通過構(gòu)建豚鼠銀屑病模型,考察芥子氣霜對豚鼠銀屑病模型皮膚的病理改善及其治療銀屑病的可能作用機(jī)制。同時采用現(xiàn)代基因芯片技術(shù),通過使用隨機(jī)方差模型,篩選出銀屑病病人及健康人皮膚中顯著性差異基因,分別構(gòu)建銀屑病組與健康組差異基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),并結(jié)合基因的功能屬性,以此構(gòu)建基因-基因網(wǎng)絡(luò),尋找銀屑病發(fā)病機(jī)制中樞紐性調(diào)控基因,將其作為藥物的靶基因,進(jìn)行后續(xù)相關(guān)深入研究。同時考察前期證實的銀屑病發(fā)病機(jī)制中可能重要的TRAIL基因在網(wǎng)絡(luò)中的地位及其與其它相關(guān)基因的調(diào)控聯(lián)系。 第一部分TRAIL在銀屑病皮膚和真皮成纖維細(xì)胞中的表達(dá)研究 通過收集門診典型的銀屑病病人和正常人皮膚標(biāo)本,應(yīng)用HE病理診斷、免疫組化、real time-PCR方法明確了TRAIL在銀屑病和正常皮膚中的表達(dá)差異。同時通過體外培養(yǎng)人真皮成纖維細(xì)胞,采用免疫組化方法明確了TRAIL受體在細(xì)胞中的表達(dá)。結(jié)果表明: 1. HE染色確證了我們所選擇的病例為尋常型銀屑病,表現(xiàn)為角化過度伴角化不全,角化不全區(qū)可見Munro微膿腫,顆粒層明顯減少或消失,棘層增厚,表皮突向下延伸呈釘突狀;真皮乳頭頂部呈杵狀,其上方棘層變薄,毛細(xì)血管擴(kuò)張充血,周圍可見淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等浸潤。 2. TRAIL在銀屑病皮膚中呈陰性表達(dá),而在正常人皮膚的表皮和真皮的交界處細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中均可見棕黃色顆粒沉淀,呈強(qiáng)陽性表達(dá)。表明TRAIL在健康人皮膚和銀屑病病人皮膚中表達(dá)具有顯著性差異。 3. TRAILR1在真皮成纖維細(xì)胞上有陽性表達(dá)。 4.銀屑病和健康人皮膚組織均可檢測到TRAILmRNA的表達(dá),但表達(dá)亦具有顯著性差異。 第二部分芥子氣誘導(dǎo)真皮成纖維細(xì)胞凋亡及分泌IL-10、TRAIL的研究 本部分研究TRAIL作為治療銀屑病治療藥物新的藥物作用靶點的可行性。建立了MTT、流式細(xì)胞凋亡術(shù)、免疫組織化學(xué)、ELISA等方法,考察了芥子氣誘導(dǎo)真皮成纖維細(xì)胞凋亡規(guī)律并探討了其分子學(xué)機(jī)制。結(jié)果表明: 1.不同濃度梯度的芥子氣不同程度的誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡,抑制細(xì)胞的過度增生,各組之間的AI值和抑制細(xì)胞增生均有顯著性差異(P0.01),呈顯著劑量依賴性。 2.成纖維細(xì)胞在芥子氣作用后,其細(xì)胞的胞膜和胞漿有TRAILR1的強(qiáng)表達(dá)。 3.真皮成纖維細(xì)胞自身可以分泌IL-10、TRAIL,SM刺激后可以顯著上調(diào)IL-10、TRAIL的表達(dá),(P0.05),且分泌趨勢呈明顯的量效和時效關(guān)系。 第三部分芥子氣霜對豚鼠銀屑病樣模型作用的研究 本部分通過將5%心得安乳膏涂在豚鼠耳部背側(cè)皮膚,構(gòu)建了類似銀屑病的表皮角化過度、角化不全和棘層肥厚等類似病理特征的豚鼠銀屑病樣模型,從整體角度考察芥子氣霜用藥前后HE病理染色、TRAIL表達(dá)、豚鼠血清中可溶性TRAIL分泌來研究芥子氣霜治療銀屑病可能作用機(jī)制。結(jié)果表明: 1.成功構(gòu)建增生型的豚鼠銀屑病模型,HE結(jié)果和耳緣皮膚的增厚特點確證了我們所建立的模型符合研究要求。 2.芥子氣霜涂敷或可溶性TRAIL因子皮下注射均很大程度上改善了銀屑病病理癥狀,有效的抑制了表皮的過度增生和炎性細(xì)胞的浸潤。 3.芥子氣霜和TRAIL治療后,刺激皮膚基底層和棘層TRAIL蛋白的強(qiáng)陽性表達(dá)。表達(dá)部位位于胞膜和胞漿處。 第四部分銀屑病皮損組織基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建分析研究 本研究利用基因芯片的數(shù)據(jù)構(gòu)建了三種不同層面的網(wǎng)絡(luò):蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的作用網(wǎng)絡(luò)、基因間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和代謝網(wǎng)絡(luò)。我們利用差異基因構(gòu)建了基因-基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖,揭示出有功能屬性的基因群,及彼此之間相互關(guān)系,從一個整體基因群角度去理解銀屑病發(fā)病機(jī)制,尋找銀屑病發(fā)病機(jī)制中樞紐性調(diào)控基因。同時考察前期證實的銀屑病發(fā)病機(jī)制中可能重要的TRAIL基因在網(wǎng)絡(luò)中的地位及與其它相關(guān)基因的調(diào)控聯(lián)系。結(jié)果表明: 1.基因芯片所獲得的原始數(shù)據(jù)作標(biāo)準(zhǔn)化處理,篩選出Ratio2或0.5的數(shù)據(jù)項共288個差異基因。 2.構(gòu)建銀屑病組與健康組基因的表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),尋找到含MET、TRAIL、SULT1B1等的重要功能所屬基因。這些基因涉及的功能有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、氧化還原、電子傳遞,脂類代謝、硫的代謝、凋亡調(diào)控、碳水化合物的代謝。并挖掘出它們之間相互調(diào)控關(guān)系。 3.比較了銀屑病樣本和正常樣本的網(wǎng)絡(luò)密度和聚類系數(shù),我們發(fā)現(xiàn)了健康組基因的密度大于疾病組,在網(wǎng)絡(luò)圖中看到基因的相互作用關(guān)系顯然是健康組大于銀屑病組,凝聚度方面兩個網(wǎng)絡(luò)沒有顯著性差異。從聚類系數(shù)得到,兩個網(wǎng)絡(luò)中核心調(diào)控基因?qū)ζ渌虻恼{(diào)控能力是沒有顯著性差異,可能正常樣本基因間的調(diào)控更容易實現(xiàn),網(wǎng)絡(luò)更穩(wěn)定。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R758.63
【部分圖文】：

圖 1-1 銀屑病皮膚 HE 染色Fig.1-1 HE staining results of skin tissue from the lesion of psoriatic pa 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代在整個實驗中，我們采用的是經(jīng)原代培養(yǎng)，傳代10-20代的真皮成纖置相差顯微鏡下觀察，真皮成纖維細(xì)胞呈梭形或長纖維狀，胞體狹長，胞漿豐富，細(xì)胞核卵圓形，靠近胞質(zhì)中央。細(xì)胞排列規(guī)則，成漩渦，隨細(xì)胞增殖而布滿培養(yǎng)皿底部，培養(yǎng)2-3 d即可融合。免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果.1銀屑病皮膚中疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，TRAIL在銀屑病皮膚中呈陰性表達(dá)，而在正常皮和真皮的交界處細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中均可見棕黃色顆粒沉淀，呈強(qiáng)陽圖1-2所示，表明TRAIL在健康人皮膚和銀屑病病人皮膚中表達(dá)是有顯

第二軍醫(yī)大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一部分圖1-2 TRAIL在銀屑病和健康人皮膚上表達(dá)的免疫組化分析（放大倍數(shù)：200倍）A:銀屑病皮膚TRAIL陰性表達(dá) B:健康人皮膚TRAIL陽性表達(dá)Fig.1-2 Immunohistochemical staining results of TRAIL in psoriatic patient andhealthy subject(Magnification:×200)A: negative expression of TRAIL in psoriasis B: positive expression of TRAIL inhealthy subject3.3.2真皮成纖維細(xì)胞中免疫組化結(jié)果顯示，相對陰性對照，在真皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞漿和細(xì)胞核中均可見棕黃色顆粒沉淀，如圖1-3所示，表明TRAILR1在真皮成纖維細(xì)胞上有陽性表達(dá)。

realtime-PCR 研究。A B圖1-4 總RNA甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳（5V.cm-1）A:樣本組織 B:真皮成纖維細(xì)胞Fig.1-4 Electrophoresis pattern of total RNA （5V.cm-1）A: Sample tissue B:Fibroblasts3.4.2 溶解曲線使用改良后的TaKaRa SYBR(R)Premix Ex TaqTM進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可以有效的抑制非特異性PCR擴(kuò)增，提高PCR擴(kuò)增靈敏度。通過PCR反應(yīng)生成雙鏈DNA，SYBR Green I與雙鏈DNA結(jié)合發(fā)生熒光，通過檢測反應(yīng)液中SYBR Green I的熒光強(qiáng)度不但可以檢測反應(yīng)體系中的DNA擴(kuò)增量，同時還能測定擴(kuò)增產(chǎn)物的DNA溶解（Tm）溫度。TRAIL和β-actin的Tm值分別為75.66和88.52℃。其溶解曲線分別見圖1-5。28S18S
【參考文獻(xiàn)】

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1 管海宏,劉玉峰,沈柱;天然免疫紊亂與銀屑病[J];國外醫(yī)學(xué).皮膚性病學(xué)分冊;2005年05期

本文編號：2879834