研究背景及目的 皮膚老化分內(nèi)源性老化和外源性老化,內(nèi)源性因素引起的皮膚老化是不可避免的自然過(guò)程,其具體機(jī)制尚不清楚。在外源性因素中,紫外線的作用是最主要和最突出的因素,由于皮膚反復(fù)暴露于紫外線中造成的皮膚老化稱為光老化(Photoaging)。光老化的皮膚發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能的特征性改變,臨床上這些特征性改變包括:皺紋、皮膚松弛、粗糙萎縮、斑點(diǎn)狀色素沉著、雀斑、毛細(xì)血管擴(kuò)張、甚至癌變。 成纖維細(xì)胞是真皮中最主要的細(xì)胞成分,紫外線(UV)照射導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的過(guò)早衰老,膠原合成能力下降,基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)表達(dá)升高,細(xì)胞外基質(zhì)降解是皮膚光老化的最重要原因。紫外線依其波長(zhǎng)分為短波紫外線UVC(200～280 nm)、中波紫外線UVB(280～320 nm)和長(zhǎng)波紫外線UVA(320～400 nm)。99%的UVA到達(dá)地球表面,超過(guò)50%的UVA穿透表皮到達(dá)真皮層,作用于成纖維細(xì)胞。因此,UVA與人體皮膚關(guān)系密切,在皮膚光老化的發(fā)生日顯重要,并受到各國(guó)公共衛(wèi)生學(xué)者的關(guān)注。 在皮膚光老化發(fā)生的機(jī)制方面,因UV照射產(chǎn)生氧自由基學(xué)說(shuō)是目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者普遍承認(rèn)的衰老理論之一,因而,近年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者針對(duì)UVA照射產(chǎn)生的氧自由基進(jìn)行了大量的體內(nèi)外抗氧化研究,但至今尚未找到確切的抗光老化方法。隨著對(duì)光老化發(fā)生機(jī)制的研究深入,研究者發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子之間的調(diào)控對(duì)皮膚光老化起著很重要的作用,細(xì)胞因子在光老化中的作用越來(lái)越受到重視。但從細(xì)胞因子角度抗皮膚光老化的研究報(bào)道甚少。 本研究旨在探討不同劑量UVA照射體外培養(yǎng)的皮肽成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成和TGF-β1表達(dá)情況;探討加入TGF-β1對(duì)膠原合成的影響;TGF-β1對(duì)UVA照射體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞MMP-1、MMP-3高表達(dá)有無(wú)抑制作用;對(duì)UVA照射導(dǎo)致的線粒體脫氧核糖核酸(mtDNA)缺失有無(wú)保護(hù)作用,以及TGF-β1對(duì)熱休克蛋白70(HSP70)表達(dá)的影響,全面系統(tǒng)的探討TGF-β1對(duì)UVA照射體外培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞光老化的保護(hù)作用,以及TGF-β1對(duì)UVA照射體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞IGF-1、KGF,VEGF分泌的影響。 研究方法: 1.取年輕成人包皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)傳代,用第5代細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)對(duì)象,進(jìn)行細(xì)胞分組。采用不同計(jì)量的UVA(5 J/cm~2、10J/cm~2、20J/cm~2)照射,設(shè)立對(duì)照組(0 J/cm~2.),建立成纖維細(xì)胞光老化模型。培養(yǎng)24h后采用四甲基偶氮唑鹽比色(MTT)法檢測(cè)照射后細(xì)胞增殖活性,酶聯(lián)免疫(ELISA)法測(cè)定UVA照射皮膚成纖維細(xì)胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型膠原和TGF-β1蛋白含量,半定量RT—PCR檢測(cè)Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA、TGF-β1mRNA表達(dá)水平。 2.在培養(yǎng)液中分別加入不同劑量TGF-β1,即小劑量(0.1ng/ml)、中劑量(1.0 ng/ml)、大劑量(10.0 ng/ml),用UVA15J/cm~2照射,采用酶聯(lián)免疫(ELISA)法測(cè)定TGF-β1對(duì)UVA照射皮膚成纖維細(xì)胞上清液中Ⅰ型、Ⅲ型膠原含量,HSP70表達(dá)變化;半定量RT—PCR檢測(cè)Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA和MMP-1、MMP-3 mRNA、Smad3 mRNA表達(dá)變化,線粒體DNA(mtDNA)4977bp缺失情況。采用酶聯(lián)免疫(ELISA)法測(cè)定TGF-β1對(duì)UVA照射體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞上清液中IGF-1、KGF、VEGF含量的影響。 研究結(jié)果: 1.不同劑量的UVA(5 J/cm~2、10J/cm~2、20J/cm~2)照射體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞結(jié)果顯示:隨著UVA照射劑量增加,成纖維細(xì)胞OD值下降,與對(duì)照組比較,UVA 10 J/cm~2、UVA 20 J/cm~2照射組OD值明顯下降,有非常顯著性差異(P＜0.01)。Ⅰ型膠原含量和mRNA表達(dá),隨著UVA照射劑量增加而降低,呈劑量依賴關(guān)系。與對(duì)照組比較,UVA 10 J/cm~2、UVA 20 J/cm~2照射組降低明顯(P＜0.05,P＜0.01),UVA 20 J/cm~2組抑制膠原合成作用更加明顯,與對(duì)照組及其它兩組比較,有非常顯著性差異(P＜0.01)。Ⅲ型膠原含量和mRNA表達(dá),與對(duì)照組比較,UVA 20 J/cm~2照射組明顯降低,有非常顯著性差異(P＜0.01)。TGF-β1蛋白含量和mRNA表達(dá)隨著UVA照射劑量增加而降低,呈劑量依賴關(guān)系。與對(duì)照組比較,UVA 10 J/cm~2、UVA 20 J/cm~2照射組,TGF-β1蛋白含量和mRNA表達(dá)明顯降低,有非常顯著性差異(P＜0.01)。 2.本實(shí)驗(yàn)通過(guò)UVA15 J/cm~2照射不同劑量TGF-β1處理后的成纖維細(xì)胞,結(jié)果顯示:隨著TGF-β1劑量增加,大、中劑量組成纖維細(xì)胞OD值明顯高于UVA照射組,有非常顯著性差異(P＜0.01)。Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量隨著TGF-β1劑量增加而增加,呈劑量依賴關(guān)系。大、中劑量組與UVA照射組比較,具有顯著性差異(P＜0.01,P＜0.05),大劑量組促進(jìn)膠原合成作用更明顯,有非常顯著性差異(P＜0.01)。Ⅰ型、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá),隨著TGF-β1劑量增加而升高,呈劑量依賴關(guān)系。Ⅰ型膠原mRNA表達(dá)在大、中劑量組明顯升高,與UVA照射組比較,有非常顯著性差異(P＜0.01)。Ⅲ型膠原mRNA表達(dá),大劑量組與UVA照射組比較,有非常顯著性差異(P＜0.01)。 不同劑量UVA照射后MMP-1、MMP-3mRNA表達(dá)與對(duì)照組比較,UVA 10J/cm~2、UVA 20 J/cm~2照射組,MMP-1、MMP-3mRNA表達(dá)明顯升高,有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.01),UVA 20 J/cm~2組MMP-1、MMP-3mRNA表達(dá)升高更明顯,有非常顯著性差異(P＜0.01)。UVA照射前給予不同劑量TGF-β1處理,MMP-1、MMP-3 mRNA表達(dá)隨著TGF-β1劑量增加表達(dá)降低,呈劑量依賴關(guān)系。MMP-1 mRNA表達(dá),在大、中劑量組明顯低于UVA照射組,有非常顯著性差異(P＜0.01);MMP-3 mRNA表達(dá),大劑量組明顯低于UVA照射組,有非常顯著性差異(P＜0.01),中劑量組與UVA照射組比較有顯著性差異(P＜0.05)。 不同劑量UVA照射后,各照射組Smad3表達(dá)降低于對(duì)照組,UVA 10 J/cm~2、UVA 20 J/cm~2照射組Smad3表達(dá)與對(duì)照組比較,有非常顯著性差異(P＜0.01),5J/cm~2照射劑量組與對(duì)照組比較,有顯著性差異(P＜0.05)。UVA照射前給予不同劑量TGF-β1處理,隨著TGF-β1劑量增加,Smad3 mRNA表達(dá)升高,呈劑量依賴關(guān)系。大、中劑量組Smad3mRNA升高較明顯,與UVA照射組比較,有非常顯著性差異(P＜0.01)。小劑量組與UVA照射組比較,有顯著性差異(P＜0.05)。 3.培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)UVA360nm照射,UVA累積劑量為UVA60J/cm~2后發(fā)生mtDNA 4977 bp缺失,UVA90J/cm~2時(shí)缺失明顯(P＜0.01)。TGF-β1處理后,大劑量組mtDNA 4977 bp缺失減輕,與UVA照射組比較,有非常顯著性差異(P＜0.01),中、小劑量組與UVA照射組比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 4.不同劑量UVA照射能呈現(xiàn)出劑量依賴的抑制HSP70表達(dá),與對(duì)照組比較,UVA 10 J/cm~2,UVA 20 J/cm~2照射組,HSP70含量明顯降低,有顯著性差異(P＜0.05,P＜0.01),UVA 20 J/cm~2照射組抑制作用更明顯,與對(duì)照組比較,有非常顯著性差異(P＜0.01)。照射前給予TGF-β1處理后,HSP70含量隨著TGF-β1劑量增加而升高,呈劑量依賴關(guān)系。大劑量組HSP70含量明顯高于UVA照射組,有非常顯著性差異(P＜0.01),中劑量組HSP70含量高于UVA照射組,有顯著性差異(P＜0.05)。 5.UVA照射體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞導(dǎo)致IGF-1、KGF分泌下降,UVA10 J/cm~2、UVA 20 J/cm~2照射組明顯下降,與對(duì)照組比較,有非常顯著性差異(P＜0.01)。VEGF分泌升高,UVA 20 J/cm~2照射組與對(duì)照組比較,有非常顯著性差異(P＜0.01)。TGF-β1處理后,TGF-β1劑量依賴性地提高UVA照射體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞分泌三種因子的水平。大劑量組IGF-1、KGF、VEGF含量明顯升高,與UVA照射組比較,有非常顯著性差異((P＜0.01)。 結(jié)論: 1.UVA照射體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞,導(dǎo)致細(xì)胞衰老,增殖活性下降;對(duì)Ⅰ型、Ⅲ型膠原合成有抑制作用,降低TGF-β1蛋白含量和mRNA表達(dá)水平,隨UVA照射劑量增加而下降。提示UVA照射對(duì)膠原合成抑制作用與TGF-β1低表達(dá)有關(guān),TGF-β1低表達(dá)和TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)通路受影響有關(guān),在UVA照射導(dǎo)致的皮膚光老化發(fā)生過(guò)程中有著重要的作用。 2.在UVA照射前加入TGF-β1,能提高體外培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞增殖活性,以劑量依賴方式促進(jìn)UVA照射成纖維細(xì)胞Ⅰ型、Ⅲ型膠原的合成和mRNA表達(dá)。UVA照射成纖維細(xì)胞后,誘導(dǎo)MMP-1、MMP-3mRNA高表達(dá),Smad3低表達(dá);TGF-β1能降低MMP-1、MMP-3mRNA表達(dá),增強(qiáng)Smad3表達(dá),對(duì)UVA照射成纖維細(xì)胞光老化有保護(hù)作用。作用機(jī)制可能是TGF-β1促進(jìn)成纖維細(xì)胞分裂增殖,TpR-Ⅱ表達(dá)增加,增強(qiáng)了TpR-Ⅱ?qū)GF-β的效應(yīng)能力,促進(jìn)成纖維細(xì)胞膠原合成,并通過(guò)TGF-β/Smad途徑抑制MMP-1、MMP-3mRNA高表達(dá)。 3.培養(yǎng)皮膚成纖維細(xì)胞經(jīng)UVA360nm照射,UVA累積劑量為UVA60J/cm~2后發(fā)生mtDNA 4977 bp缺失,UVA90J/cm~2時(shí)缺失明顯。給予一定劑量(10ng/ml)的TGF-β1后,可以使皮膚成纖維細(xì)胞mtDNA4977 bp缺失減輕。 4.UVA照射抑制成纖維細(xì)胞對(duì)HSP70的表達(dá),TGF-β1能使UVA照射成纖維細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)升高,TGF-β1誘導(dǎo)UVA照射成纖維細(xì)胞內(nèi)的HSP70高表達(dá),對(duì)UVA照射成纖維細(xì)胞有保護(hù)作用。 5.TGF-β1可提高UVA照射體外培養(yǎng)的皮膚成纖維細(xì)胞分泌IGF-1、KGF、VEGF三種細(xì)胞因子的水平,有利于真皮內(nèi)結(jié)構(gòu)的恢復(fù)和重建,有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
【學(xué)位單位】：昆明醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R751
【部分圖文】：

昆明醫(yī)學(xué)院博士學(xué)位論文鏡照片:正常成纖維細(xì)胞呈細(xì)長(zhǎng)梭狀，細(xì)胞膜表面有許多小突起，毛和胞漿皺折，線粒體形態(tài)正常，膜結(jié)構(gòu)完整，基質(zhì)均勻，靖規(guī)則。成纖維vA照射20JIem早后，細(xì)胞膜表面小突起減少，線粒體腫脹，膜結(jié)構(gòu)不不均勻，蜻排列紊亂，細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)空泡，核膜內(nèi)折。!

照射后的成纖維細(xì)胞透射電鏡照片(x40(犯)

圖3照射后的成纖維細(xì)胞透射電鏡照片(x12儀犯)成纖維細(xì)胞線粒體腫脹，體積增大深染劑量UVA照射對(duì)成纖維細(xì)胞增殖活性的影響(M)顯示:隨著UVA照射劑量增加，成纖維細(xì)胞OD值下降，與對(duì)照組Jz‘mZ、UVA20Jlcmz照射組，oD值下降明顯，有非常顯著性)，說(shuō)明隨著UvA照射劑量增加，成纖維細(xì)胞損傷加重，增殖活性明Jlc擴(kuò)照射劑量組OD值與對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異(P>0.05)。表2.不同劑量Uv人照射對(duì)成纖維細(xì)胞OD值的影響住士s，n=32)別nOD值
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2871760