目的:黑色素瘤是最具侵襲性的皮膚腫瘤,在過去的幾十年中,黑色素瘤的發(fā)病率一直在增加。特別是皮膚黑色素瘤占全世界新發(fā)惡性腫瘤病例的1.6%,且發(fā)病率在世界上以每年2-7%的速率增長。傳統(tǒng)的療法如外科手術、化療、放療的治療效果仍然不理想,因此研究人員致力于尋找對腫瘤細胞影響大并對正常細胞毒性最小的藥物。近年來,中草藥有效成分的作用越來越受到全世界的關注,其對腫瘤作用的研究是腫瘤研究領域的新方向。小豆蔻明作為草豆蔻的種子中提取的生物堿類單體成分,具有廣泛的生物活性和抗腫瘤作用。目前,研究已證實小豆蔻明對多種腫瘤細胞具有抑制作用,但仍無小豆蔻明針對黑色素瘤細胞作用的研究。本研究主要通過小豆蔻明處理黑素瘤M14細胞系,觀察其對M14細胞增殖、凋亡及相關凋亡蛋白的影響,探討其可能的機制。方法:1.細胞培養(yǎng)。將黑色素瘤M14細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基,放入37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.使用MTS法檢測小豆蔻明對黑色素瘤M14細胞增殖的影響。實驗設3組:空白對照組只加培養(yǎng)基無細胞無小豆蔻明,陰性對照組為有含細胞的培養(yǎng)基且無小豆蔻明,實驗組為含有細胞的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基加有以下濃度的小豆蔻明(30、60、90、120μmol/L),每組6個復孔。培養(yǎng)24h,48h,72h后加入MTS檢測小豆蔻明對黑色素瘤M14細胞增殖活力的影響,計算不同濃度藥物濃度下細胞的存活率。3.應用流式細胞術檢測小豆蔻明對黑色素瘤M14細胞凋亡的影響。實驗設2組:陰性對照組為含有細胞的培養(yǎng)基且無小豆蔻明,實驗組為含有細胞的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基加有以下濃度的小豆蔻明(30、60、90μmol/L)。培養(yǎng)24小時后進行檢測。4.應用實時熒光定量PCR法(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)檢測測經(jīng)小豆蔻明藥物處理后的M14細胞凋亡相關基因(BAX和BCL2)在mRNA水平的表達。實驗設2組陰性對照組為含有細胞的培養(yǎng)基且無小豆蔻明,實驗組為含有細胞的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基加有以下濃度的小豆蔻明(30、60、90μmol/L)。培養(yǎng)24小時后提取RNA進行檢測。5.應用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測經(jīng)小豆蔻明藥物處理后的凋亡相關蛋白(BAX,BCL2,Cleaved Caspase8,Cleaved Caspase9、Cleaved PARP以及P65)的表達情況。實驗設2組:陰性對照組為含有細胞的培養(yǎng)基且無小豆蔻明,實驗組為含有細胞的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基加有以下濃度的小豆蔻明(30、60、90μmol/L)。培養(yǎng)24小時后提取蛋白進行檢測。結果:1.MTS結果顯示,經(jīng)過不同濃度的小豆蔻明處理24h后黑色素瘤M14細胞的存活率分別為(87.9±4.2)%,(78.2±2.4)%、(70.1±2.2)%、(44.0±3.2)%,通過兩兩比較,各實驗組與陰性對照組間的差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);小豆蔻明處理48小時的存活率分別為(76.0±1.6)%、(35.5±2.2)%、(32.0±1.3)%、(23.5±1.7)%,經(jīng)兩兩比較,各實驗組與陰性對照組間的差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05);小豆蔻明處理72小時的存活率分別為(40.1±1.3)%、(34.6±2.3)%、(23±2.2)%、(18.3±2.0)%,經(jīng)兩兩比較,各實驗組與陰性對照組間的差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。2.流式細胞術結果顯示濃度不同的小豆蔻明處理黑色素瘤M14細胞24小時后細胞凋亡情況,隨著小豆蔻明劑量的增加,Annexin V陽性細胞(早期凋亡細胞與晚期凋亡細胞之和)的比例也在逐步增加。3.RT-qPCR結果顯示,濃度不同的小豆蔻明處理黑色素瘤M14細胞24小時,在mRNA水平BAX基因的表達量依次為1.595±0.141,2.201±0.388,2.411±0.442,陰性對照組為1.002±0.087,經(jīng)兩兩比較對照組與30μmol/L,60μmol/L,90μmol/L組間差異差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05),其余各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05);在mRNA水平BCL2基因的表達量依次為0.755±0.044,0.617±0.004,0.536±0.074,陰性對照組為1.008±0.180,經(jīng)兩兩比較陰性對照組與60μmol/L、90μmol/L組間差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),其余各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。4.Western blot結果顯示:黑色素瘤M14細胞經(jīng)不同濃度的小豆蔻明處理24h,BAX蛋白表達量依次為0.0.326±0.017,0.585±0.013,0.643±0.005,陰性對照組為0.307±0.008,經(jīng)過兩兩比較各實驗組與陰性對照組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);BCL2蛋白表達量依次為0.501±0.007,0.465±0.011,0.409±0.01,陰性對照組為0.537±0.007,經(jīng)過兩兩比較各實驗組與陰性對照組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);Cleaved Caspase 8蛋白表達量依次為0.592±0.023,0.872±0.022,0.949±0.0259,陰性對照組為0.437±0.003,經(jīng)過兩兩比較各實驗組與陰性對照組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);Cleaved Caspase 9蛋白表達量依次為0.666±0.013,0.915±0.013,0.979±0.007陰性對照組為0.507±0.014,經(jīng)過兩兩比較各實驗組與陰性對照組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);Cleaved PARP蛋白表達量依次為0.320±0.006,0.900±0.025,0.979±0.009,陰性對照組為0.175±0.003,經(jīng)過兩兩比較各實驗組與陰性對照組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05);P65蛋白表達量依次為0.720±0.006,0.630±0.008,0.439±0.003,陰性對照組為0.811±0.011,經(jīng)過兩兩比較各實驗組與陰性對照組之間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:1.在一定濃度和時間范圍內(nèi),小豆蔻明對黑色素瘤M14細胞具有明顯的增殖抑制作用,且呈時間-劑量依賴性。2.在一定濃度和時間范圍內(nèi),小豆蔻明可誘導黑色素瘤M14細胞凋亡,且隨著濃度的升高,誘導凋亡作用越顯著。3.小豆蔻明誘導黑色素瘤M14細胞的凋亡作用可能與內(nèi)源性和外源性凋亡通路有關。
【學位單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.5
【部分圖文】：

同濃度的小豆蔻明作用不同時間對黑色素瘤 M14 細率的影響liferation inhibition of melanoma M14 cells after of cardamonin in different concentrations and times式細胞術結果顯示濃度不同的小豆蔻明處理黑色素黑色素瘤 M14 細胞凋亡情況如圖所示，隨著小豆蔻

的小豆蔻明作用 24h 黑色素瘤 M14 細 treated with different concentration of caapoptosis was detected by flow cytometr結果顯示，濃度不同的小豆蔻明處理黑RNA 水平 BAX 基因的表達量依次411±0.442，陰性對照組為 1.002±0.087，60μmol/L, 90μmol/L 組間差異差異具有之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在 m次為 0.755±0.044，0.617±0.004，0.5360，經(jīng)兩兩比較對照組與 60μmol/L, 90μ0.05），其余各組之間差異無統(tǒng)計學意

同濃度的小豆蔻明作用 24h 黑色素瘤 M14 細胞的4 Cells treated with different concentration of cardamoapoptosis was detected by flow cytometryqPCR 結果顯示，濃度不同的小豆蔻明處理黑色素在 mRNA 水平 BAX 基因的表達量依次為 188，2.411±0.442，陰性對照組為 1.002±0.087，經(jīng)兩ol/L, 60μmol/L, 90μmol/L 組間差異差異具有統(tǒng)計余各組之間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在 mRN達量依次為 0.755±0.044，0.617±0.004，0.536±0.078±0.180，經(jīng)兩兩比較對照組與 60μmol/L, 90μmol/L義（P＜0.05），其余各組之間差異無統(tǒng)計學意義（P
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本文編號：2864832