目的:黑色素瘤是最具侵襲性的皮膚腫瘤,在過去的幾十年中,黑色素瘤的發(fā)病率一直在增加。特別是皮膚黑色素瘤占全世界新發(fā)惡性腫瘤病例的1.6%,且發(fā)病率在世界上以每年2-7%的速率增長(zhǎng)。傳統(tǒng)的療法如外科手術(shù)、化療、放療的治療效果仍然不理想,因此研究人員致力于尋找對(duì)腫瘤細(xì)胞影響大并對(duì)正常細(xì)胞毒性最小的藥物。近年來,中草藥有效成分的作用越來越受到全世界的關(guān)注,其對(duì)腫瘤作用的研究是腫瘤研究領(lǐng)域的新方向。小豆蔻明作為草豆蔻的種子中提取的生物堿類單體成分,具有廣泛的生物活性和抗腫瘤作用。目前,研究已證實(shí)小豆蔻明對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有抑制作用,但仍無小豆蔻明針對(duì)黑色素瘤細(xì)胞作用的研究。本研究主要通過小豆蔻明處理黑素瘤M14細(xì)胞系,觀察其對(duì)M14細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)凋亡蛋白的影響,探討其可能的機(jī)制。方法:1.細(xì)胞培養(yǎng)。將黑色素瘤M14細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基,放入37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2.使用MTS法檢測(cè)小豆蔻明對(duì)黑色素瘤M14細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)3組:空白對(duì)照組只加培養(yǎng)基無細(xì)胞無小豆蔻明,陰性對(duì)照組為有含細(xì)胞的培養(yǎng)基且無小豆蔻明,實(shí)驗(yàn)組為含有細(xì)胞的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基加有以下濃度的小豆蔻明(30、60、90、120μmol/L),每組6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h,48h,72h后加入MTS檢測(cè)小豆蔻明對(duì)黑色素瘤M14細(xì)胞增殖活力的影響,計(jì)算不同濃度藥物濃度下細(xì)胞的存活率。3.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小豆蔻明對(duì)黑色素瘤M14細(xì)胞凋亡的影響。實(shí)驗(yàn)設(shè)2組:陰性對(duì)照組為含有細(xì)胞的培養(yǎng)基且無小豆蔻明,實(shí)驗(yàn)組為含有細(xì)胞的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基加有以下濃度的小豆蔻明(30、60、90μmol/L)。培養(yǎng)24小時(shí)后進(jìn)行檢測(cè)。4.應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(Real-time quantitative PCR,RT-q PCR)檢測(cè)測(cè)經(jīng)小豆蔻明藥物處理后的M14細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(BAX和BCL2)在mRNA水平的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)設(shè)2組陰性對(duì)照組為含有細(xì)胞的培養(yǎng)基且無小豆蔻明,實(shí)驗(yàn)組為含有細(xì)胞的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基加有以下濃度的小豆蔻明(30、60、90μmol/L)。培養(yǎng)24小時(shí)后提取RNA進(jìn)行檢測(cè)。5.應(yīng)用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測(cè)經(jīng)小豆蔻明藥物處理后的凋亡相關(guān)蛋白(BAX,BCL2,Cleaved Caspase8,Cleaved Caspase9、Cleaved PARP以及P65)的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)2組:陰性對(duì)照組為含有細(xì)胞的培養(yǎng)基且無小豆蔻明,實(shí)驗(yàn)組為含有細(xì)胞的培養(yǎng)基,培養(yǎng)基加有以下濃度的小豆蔻明(30、60、90μmol/L)。培養(yǎng)24小時(shí)后提取蛋白進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:1.MTS結(jié)果顯示,經(jīng)過不同濃度的小豆蔻明處理24h后黑色素瘤M14細(xì)胞的存活率分別為(87.9±4.2)%,(78.2±2.4)%、(70.1±2.2)%、(44.0±3.2)%,通過兩兩比較,各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);小豆蔻明處理48小時(shí)的存活率分別為(76.0±1.6)%、(35.5±2.2)%、(32.0±1.3)%、(23.5±1.7)%,經(jīng)兩兩比較,各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);小豆蔻明處理72小時(shí)的存活率分別為(40.1±1.3)%、(34.6±2.3)%、(23±2.2)%、(18.3±2.0)%,經(jīng)兩兩比較,各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示濃度不同的小豆蔻明處理黑色素瘤M14細(xì)胞24小時(shí)后細(xì)胞凋亡情況,隨著小豆蔻明劑量的增加,Annexin V陽性細(xì)胞(早期凋亡細(xì)胞與晚期凋亡細(xì)胞之和)的比例也在逐步增加。3.RT-qPCR結(jié)果顯示,濃度不同的小豆蔻明處理黑色素瘤M14細(xì)胞24小時(shí),在mRNA水平BAX基因的表達(dá)量依次為1.595±0.141,2.201±0.388,2.411±0.442,陰性對(duì)照組為1.002±0.087,經(jīng)兩兩比較對(duì)照組與30μmol/L,60μmol/L,90μmol/L組間差異差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);在mRNA水平BCL2基因的表達(dá)量依次為0.755±0.044,0.617±0.004,0.536±0.074,陰性對(duì)照組為1.008±0.180,經(jīng)兩兩比較陰性對(duì)照組與60μmol/L、90μmol/L組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.Western blot結(jié)果顯示:黑色素瘤M14細(xì)胞經(jīng)不同濃度的小豆蔻明處理24h,BAX蛋白表達(dá)量依次為0.0.326±0.017,0.585±0.013,0.643±0.005,陰性對(duì)照組為0.307±0.008,經(jīng)過兩兩比較各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);BCL2蛋白表達(dá)量依次為0.501±0.007,0.465±0.011,0.409±0.01,陰性對(duì)照組為0.537±0.007,經(jīng)過兩兩比較各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Cleaved Caspase 8蛋白表達(dá)量依次為0.592±0.023,0.872±0.022,0.949±0.0259,陰性對(duì)照組為0.437±0.003,經(jīng)過兩兩比較各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Cleaved Caspase 9蛋白表達(dá)量依次為0.666±0.013,0.915±0.013,0.979±0.007陰性對(duì)照組為0.507±0.014,經(jīng)過兩兩比較各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);Cleaved PARP蛋白表達(dá)量依次為0.320±0.006,0.900±0.025,0.979±0.009,陰性對(duì)照組為0.175±0.003,經(jīng)過兩兩比較各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);P65蛋白表達(dá)量依次為0.720±0.006,0.630±0.008,0.439±0.003,陰性對(duì)照組為0.811±0.011,經(jīng)過兩兩比較各實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi),小豆蔻明對(duì)黑色素瘤M14細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用,且呈時(shí)間-劑量依賴性。2.在一定濃度和時(shí)間范圍內(nèi),小豆蔻明可誘導(dǎo)黑色素瘤M14細(xì)胞凋亡,且隨著濃度的升高,誘導(dǎo)凋亡作用越顯著。3.小豆蔻明誘導(dǎo)黑色素瘤M14細(xì)胞的凋亡作用可能與內(nèi)源性和外源性凋亡通路有關(guān)。
【學(xué)位單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R739.5
【部分圖文】：

同濃度的小豆蔻明作用不同時(shí)間對(duì)黑色素瘤 M14 細(xì)率的影響liferation inhibition of melanoma M14 cells after of cardamonin in different concentrations and times式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示濃度不同的小豆蔻明處理黑色素黑色素瘤 M14 細(xì)胞凋亡情況如圖所示，隨著小豆蔻

的小豆蔻明作用 24h 黑色素瘤 M14 細(xì) treated with different concentration of caapoptosis was detected by flow cytometr結(jié)果顯示，濃度不同的小豆蔻明處理黑RNA 水平 BAX 基因的表達(dá)量依次411±0.442，陰性對(duì)照組為 1.002±0.087，60μmol/L, 90μmol/L 組間差異差異具有之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在 m次為 0.755±0.044，0.617±0.004，0.5360，經(jīng)兩兩比較對(duì)照組與 60μmol/L, 90μ0.05），其余各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

同濃度的小豆蔻明作用 24h 黑色素瘤 M14 細(xì)胞的4 Cells treated with different concentration of cardamoapoptosis was detected by flow cytometryqPCR 結(jié)果顯示，濃度不同的小豆蔻明處理黑色素在 mRNA 水平 BAX 基因的表達(dá)量依次為 188，2.411±0.442，陰性對(duì)照組為 1.002±0.087，經(jīng)兩ol/L, 60μmol/L, 90μmol/L 組間差異差異具有統(tǒng)計(jì)余各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在 mRN達(dá)量依次為 0.755±0.044，0.617±0.004，0.536±0.078±0.180，經(jīng)兩兩比較對(duì)照組與 60μmol/L, 90μmol/L義（P＜0.05），其余各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P
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