目的:本研究旨在探討富含鞘磷脂的脂膜微區(qū)結合酪氨酸磷酸化蛋白(phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains,PAG),人源性稱為PAG1。棕櫚�；稽c突變(即C-X-X-C突變?yōu)锳-X-X-A)對皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)A431細胞系生物學行為的影響,并進一步研究棕櫚�；稽c突變的PAG1與Src信號傳遞中相關調控分子的相關性及其分子機制。方法:通過Uniprot蛋白數據庫查詢PAG1分子結構,選擇將PAG1棕櫚�；稽c中的半胱氨酸突變?yōu)楸彼?選用A431細胞系為研究對象,用攜帶增強綠色熒光(enhanced green fluorescent protein,EGFP)信號的過表達野生型PAG1和棕櫚�；稽c突變的PAG1以及僅含有增強綠色熒光的慢病毒載體轉染A431細胞,建立了穩(wěn)定過表達野生型PAG1的A431細胞株(WT-PAG1組)、過表達PAG1棕櫚�；稽c突變的A431細胞株(mutant-PAG1組)以及只帶有綠色熒光的陰性對照組(control組)和未經處理的空白對照組(parental組)。用激光共聚焦顯微鏡檢測經慢病毒轉染后WT-PAG1組、mutant-PAG1組以及control組細胞中綠色熒光的表達情況;用流式細胞術(Flow Cytometry,FCM)檢測擴大培養(yǎng)后細胞轉染率,用分選FCM分選3組細胞中攜帶綠色熒光的細胞,并采用有限稀釋法篩選獲得單克隆目的細胞系并擴大培養(yǎng)。實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,RT-PCR)法檢測細胞內Pag1 mRNA的表達水平;蛋白印跡法(Western blot)檢測細胞內PAG1蛋白的表達水平;用細胞增殖實驗CCK8法檢測A431細胞的增殖能力;Annexin V-APC/PI雙染法檢測棕櫚�；稽c突變對A431細胞凋亡的影響;劃痕實驗和Transwell遷移檢測A431細胞的遷移能力;Transwell侵襲實驗檢測A431細胞的侵襲能力。Western Blot檢測與PAG1結合的抑制性酪氨酸激酶Csk以及Src活化信號通路中重要的信號分子Fyn的表達水平。結果:(1)在經慢病毒轉染96h后,用激光共聚焦顯微鏡觀察WT-APG1、mutant-PAG1以及control組綠色熒光幾乎遍布整個視野;FCM檢測經慢病毒轉染后,3組細胞攜帶熒光的陽性率,結果顯示control組,WT-PAG1組以及mutant-PAG1組的熒光陽性率分別為86.2%、88.1%及87.8%,隨后用RT-PCR檢測細胞中Pag1基因mRNA的表達水平,結果顯示,WT-PAG1組和mutant-PAG1組中Pag1基因mRNA的表達量分別為parental組的1.65和1.68倍,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01)。進一步用Western Blot檢測細胞中PAG1蛋白的表達水平,結果顯示,與control組相比,WT-PAG1組和mutant-PAG1組轉染后PAG1蛋白的表達量分別為control組的2.17和2.24倍,與parental組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001),證明轉染成功。(2)細胞增殖實驗結果顯示:與parental組和control組A431細胞相比,WT-PAG1組細胞增殖明顯減弱,在2-6天組間的差異具有統(tǒng)計學意義(P0.01),而mutant-PAG1組與parental組和control組A431細胞相比差異沒有統(tǒng)計學差異(P0.05),說明PAG1能明顯抑制A431細胞系的增殖,而棕櫚�；稽c突變的PAG1喪失了抑制細胞增殖的能力。(3)細胞凋亡結果顯示,parental組和control組的凋亡率分別為5.30%±0.04%和4.20%±0.06%,WT-PAG1的A431細胞凋亡明顯增加,凋亡率為11.20%±0.04%,與parental和control組相比差異具有統(tǒng)計學意義(P0.001);而mutant-PAG1組A431細胞的凋亡率為3.50%±0.04%,與parental和control組相比沒有統(tǒng)計學差異(P0.05)。(4)劃痕修復實驗結果顯示,與parental組和control組相比,WT-PAG1組細胞愈合能力明顯降低(P0.001,P0.01)。而mutant-PAG1組與parental組和control組相比沒有統(tǒng)計學差異(P0.05);Tranwell遷移實驗結果表明,WT-PAG1組細胞的遷移能力與parental和control組相比明顯降低。與WT-PAG1組相比,mutant-PAG1組細胞遷移能力明顯增高(P0.001)。(5)侵襲實驗結果顯示,WT-PAG1組細胞侵襲能力,與parental組和control組相比明顯降低。而與WT-PAG1組相比,mutant-PAG1組侵襲能力明顯增高(P0.001)。(6)Western blot結果表明,與parental組和control組相比,WT-PAG1組細胞Csk和Fyn的表達水平明顯增加(P0.001),而mutant-PAG1組與parental組和control組相比,Csk和Fyn的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。結論:(1)成功構建了穩(wěn)定過表達PAG1棕櫚�；稽c突變的A431細胞株。(2)棕櫚�；稽c突變的PAG1會減弱甚至喪失抑制皮膚鱗狀細胞癌A431細胞系增殖、誘導細胞凋亡及運動、遷徙等生物學行為的能力。(3)在cSCC中,PAG1棕櫚�；稽c突變后,通過Src家族激酶調控細胞活性的生物學功能將減弱甚至喪失。
【學位單位】：青島大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R739.5
【部分圖文】：

圖 1 PAG1 蛋白質的一級序列Fig.1 The primary protein sequence of PAG1選在棕櫚�；稽c中的半胱氨酸突變成丙氨酸，如圖 2 所示，因為這樣一方面除了原先的半胱氨酸側鏈上的活性基團，另一方面換成了體積較小，在側鏈上只

圖 2 PAG1 分子棕櫚�；稽c突變示意圖Fig.2 Schematic diagram of utation of PAG1 molecule palmitylation site為了成功將 4 種目的基因在 A431 細胞系中進行表達，提高其表達效率，本采用將目的基因包裝構建成慢病毒載體的方法，進而通過病毒感染 A431 細胞

共聚焦顯微鏡觀察經慢病毒轉染的 3 組 A431 細胞株后綠色熒光蛋白的表The fluorescence detection results of EGFP after transfection Lentivirus by laser scanning microscope (×40)測轉染效率測慢病毒感染 A431 細胞的轉染效率（圖 4），control 組，WT
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本文編號：2854613