瘢痕疙瘩是創(chuàng)傷愈合過程中形成的一種病理性瘢痕。其主要特征是成纖維細胞的異常增殖，以及以膠原為主的細胞外基質(zhì)在真皮內(nèi)過度沉積。瘢痕疙瘩在亞洲人群中較為常見，但迄今為止發(fā)病機制尚不明確。目前多采用聯(lián)合治療的方法，但仍不能解決瘢痕疙瘩的復發(fā)難題。本文集中研究在體外培養(yǎng)條件下，一些主要生物活性因子以及Ⅰ、Ⅲ型前膠原基因在瘢痕疙瘩成纖維細胞中的表達情況，比較其與正常皮膚成纖維細胞間的差別。同時，進一步研究在不同濃度曲尼司特作用下成纖維細胞增殖、生物活性因子合成和Ⅰ、Ⅲ型前膠原基因表達的變化，探討曲尼司特抗瘢痕疙瘩增生的可能機制。 首先，建立了來自瘢痕疙瘩患者和正常對照的成纖維細胞株，并比較了兩種成纖維細胞的生長曲線。在無血清培養(yǎng)條件下，兩者的一代生長期均呈指數(shù)增長。瘢痕疙瘩成纖維細胞的數(shù)量倍增時間為42小時，正常皮膚成纖維細胞的數(shù)量倍增時間為57.6小時，兩者有明顯差異。 其次，采用無血清培養(yǎng)的方法，探討正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細胞自分泌表達轉化生長因子-β_1(TGF-β_1)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和白細胞介素-6(IL-6)的能力，以及不同濃度曲尼司特對這些表達的影響。用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定各個時段各孔上清液中上述因子的含量。結果提示：(1)瘢痕疙瘩成纖維細胞較正常皮膚分泌更多的TGF-β_1，曲尼司特可以明顯抑制它的表達。與對照組相比，25μg／ml曲尼司特作用24、96小時，50μg／ml和250μg／ml曲尼司特作用24、72、96小時后，瘢痕疙瘩成纖維細胞在TGF-β_1的表達上差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(2)瘢痕疙瘩成纖維細胞分泌的bFGF較正常略微升高，曲尼司特可以促進其表達，在24、72小時尤其明顯。與對照組相比，50μg／ml曲尼司特作用24、72小時，250μg／ml曲尼司特作用24、72、96小時后，瘢痕疙瘩成纖維細胞在bFGF的表達上差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。(3)瘢痕疙瘩成纖維細胞在72、96小時較正常皮膚分泌更高的IL-6，曲尼司特可降低這種表達。與對照組相比，10μg／ml、25μg／ml和50μg／ml曲尼司特作用96小時，250μg／ml曲尼司特作用72、96小時后，瘢痕疙瘩成纖維細胞在IL-6的表達上差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。曲尼司特對正常皮膚成纖維細胞的影響大致相似。多因素方差分析顯示，濃度和時間、濃度和細胞來源、時間和細胞來源之間對上述生物活性因子的表達可產(chǎn)生不同的交互作用。 最后，進一步探討曲尼司特對正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細胞增殖及Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達的影響。曲尼司特對正常皮膚和瘢痕疙瘩Fb的形態(tài)學影響相似。較高濃度曲尼司特作用下，可觀察到Fb胞質(zhì)中有顯著的空泡形成，隨著藥物濃度增加或作用時間延長，空泡逐漸增多，且出現(xiàn)空泡的Fb也逐漸增多。這些細胞生長緩慢，最終皺縮、脫落或走向凋亡。在低濃度曲尼司特作用下，空泡化現(xiàn)象并不明顯，但隨作用時間延長，細胞間隙增寬，細胞略有皺縮。MTT法檢測顯示，加入不同濃度曲尼司特后，正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細胞的OD值較對照明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著曲尼司特的濃度增加，其OD值逐漸呈下降趨勢，提示成纖維細胞生長受抑。 繼而，采用RT—PCR方法分析瘢痕疙瘩和正常皮膚成纖維細胞在Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達上的差別，瘢痕疙瘩組Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達均較正常皮膚組有明顯增加，其中Ⅰ型約是正常皮膚組的1.28倍，Ⅲ型約是正常皮膚組的1.54倍。曲尼司特能抑制正常皮膚和瘢痕疙瘩成纖維細胞Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達，且隨著濃度增加這種作用越加明顯。與對照組相比，250μg／ml和500μg／ml曲尼司特干預后，瘢痕疙瘩成纖維細胞在Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA的表達上差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，提示其具有抑制膠原合成的能力。 綜上所述，無論在細胞增殖速度、生物活性因子自分泌，還是Ⅰ、Ⅲ型前膠原基因表達方面，瘢痕疙瘩的成纖維細胞較正常均有較明顯的不同。一定濃度的曲尼司特可減少瘢痕疙瘩成纖維細胞TGF-β_1和IL-6的表達，增加bFGF的表達，從而發(fā)揮抗纖維化的作用。曲尼司特的干預能抑制成纖維細胞增殖，抑制Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達，從而減少膠原的合成。因此，曲尼司特具有很好的臨床應用前景，可進一步進行相關的動物或人體實驗，為臨床開發(fā)奠定基礎。
【學位單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2006
【中圖分類】：R751
【部分圖文】：

1.不同濃度曲尼司特對正常皮膚和癱痕疙瘩Fb增殖的影響觀察藥物干預后Fb的形態(tài)學改變，并通過用olympus一Ix一50系統(tǒng)進行攝像，見圖3一1，2。曲尼司特對正常皮膚和癱痕疙瘩Fb的形態(tài)學影響相似。較高濃度曲尼司特作用下，可觀察到Fb胞質(zhì)中有顯著的空泡形成，隨著藥物濃度增加或作用時間延長，空泡逐漸增多，且出現(xiàn)空泡的Fb也逐漸增多。這些細胞生長緩慢，最終皺縮、脫落或走向凋亡。在低濃度曲尼司特作用下，空泡化現(xiàn)象并不明顯，但隨作用時間延長，細胞間隙增大，細胞略有皺縮。MTT法檢測顯示

礴尼碧成壽瀚繃穆管馗及I動哩喻冰揚翻刀則浦這者多時圖3一 225，留ml曲尼司特作用96h后KF細胞輕度皺縮，細胞之間空隙明顯(10、40倍)表3一1不同濃度曲尼司特對正常皮膚和癱痕疙瘩Fb增殖的影響OD值對照正常皮膚癱痕疙瘩 0.0657士0.0027 0.1183士0.005510pglml 25pglml50“glml 100pglml 250pglml500協(xié)glml 0.0433士 0.0033*0.1049士0.0081 0.0230士 0.0015*0.0685士0.0120* 0.0163士 0.0008*0.0445士0.0031* 0.0080士0.0010* 0.0325士0.0037* 0.0060士 0.0015*0.0188士0.0024* 0.0013士0.0008* 0.0045土0.0017**與對照組相比，P<0.05
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本文編號：2853039