發(fā)布時間：2020-10-22 16:39

　　 研究目的尋常痤瘡是青少年中最常見的炎癥性毛囊皮脂腺單位疾病,嚴重者導(dǎo)致?lián)p容,致郁,甚至自殺傾向。DNA甲基化參與慢性炎癥性疾病的發(fā)病,國內(nèi)外尚未見到有關(guān)痤瘡患者DNA甲基化的研究報道。通過對中重度痤瘡患者全基因組DNA異常甲基化篩查,初步明確異常DNA甲基化位點及甲基化程度,為進一步構(gòu)建痤瘡患者甲基化圖譜奠定基礎(chǔ),為闡明痤瘡的遺傳學機制積累資料。研究方法1、選取4例南方醫(yī)科大學深圳醫(yī)院門診就診且具有家族史的中重度尋常痤瘡患者的背部皮損組織與外周血,以2例健康人背部皮膚組織為對照,將患者皮損組織、外周血與健康對照者皮膚標本進行配對。2、采用DNA提取試劑盒提取皮膚組織及外周血樣本全基因組DNA。用紫外分光光度儀檢測DNA濃度及純度,1.25%瓊脂凝膠電泳檢測DNA完整性(OD260/OD280在1.7~2.0之間,總量1μg,濃度50 ng/μL,DNA條帶清晰,無彌散雜帶,為合格DNA),-80℃保存?zhèn)溆谩?、重亞硫酸氫鹽處理:使用EpiTect Bisulfite Kit重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換試劑盒,對DNA樣本進行重亞硫酸鹽處理,修飾DNA CpG島。每個樣品DNA處理總量為1μg,最多可以滿足200個候選區(qū)域片段測序檢測。4、全基因組擴增、雜交、掃描:對經(jīng)過重亞硫酸鹽處理后的樣本進行全基因組的擴增和雜交;用PCR純化試劑盒對處理后的樣本進行純化。5、全基因組DNA甲基化位點篩選:應(yīng)用Il umina Infinium Methylation EPIC BeadChip芯片技術(shù)獲得DNA甲基化信號。應(yīng)用聚類分析、GO分析、KEGG分析進行信號采集與芯片結(jié)果分析。將得到的DNA甲基化比例背景數(shù)值與甲基化芯片內(nèi)置的標準對照位點對比并矯正。研究結(jié)果病例組與皮膚對照組共計67984個CpG位點在甲基化水平上存在差異,甲基化水平增高的位點共30621個,甲基化水平降低的位點共37363個。與差異甲基化位點相對應(yīng)的基因數(shù)目共4635個,甲基化水平增高的基因有2284個,甲基化水平降低的基因共2351個,GO功能富集分析分別列出位于前10的基因功能類別條目。KEGG通路富集分析顯示差異甲基化基因主要富集于炎癥、性激素、癌癥等信號通路。研究結(jié)論AV患者的皮膚組織存在DNA異常甲基化特異基因,DNA異常甲基化可能是AV發(fā)病中的原因之一,是表觀遺傳學調(diào)控痤瘡發(fā)病的主要方式;本研究使用Ilumina Infinium Methylation EPIC BeadChip芯片技術(shù)初步建立了AV皮膚組織基因組DNA甲基化圖譜,并初步了解了這些基因的功能和信號通路,為尋常痤瘡的表觀遺傳發(fā)病機制及治療、預(yù)防奠定基礎(chǔ)。
【學位單位】：甘肅中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R758.733
【部分圖文】：

尋常痤瘡患者 DN 異常甲基化位點的篩查檢測非甲基化位點（T）。M 型微珠末尾為 G，用以檢測甲基化位點（C）。通過型與 U 型微珠熒光信號的結(jié)果計算甲基化值，見圖 2。Infinium II 設(shè)計采用 1 種，微珠末端為 C，在雜交后的單堿基延伸步驟中確定甲基化狀態(tài)，見圖 3。

編號 96 位置 樣品名稱（ng/uL）A260/280 A260/230 體積(uL) 總量(ug) 質(zhì)檢結(jié)果1 A01 C1D 102.3 1.92 2.22 55 5.6 合格2 A02 C2D 151.5 1.9 2.22 55 8.3 合格3 A03 P1D 300.3 1.89 2.27 55 16.5 合格4 A04 P2D 171.9 1.92 2.31 55 9.5 合格5 A05 P3D 187.9 1.9 2.33 55 10.3 合格6 A06 P4D 779.1 1.88 2.35 40 31.2 合格7 A07 P1B 77.7 1.79 1.68 55 4.3 合格8 A08 P2B 149.1 1.77 1.6 55 8.2 合格注：1-2 為正常皮膚對照組；3-6 為病例組；7-8 為外周血對照組2.1.2 瓊脂糖凝膠電泳法質(zhì)量檢測結(jié)果（圖 4）

色信號代表 G 堿基，紫色信號代表 T 堿基，根據(jù)甲基化原理，當綠色和藍色顯示為高信號時表示合格（信號值>5000）[23]，見圖 8 所示。以上獨立樣本質(zhì)控結(jié)果均合格，實驗流程正常，芯片狀態(tài)正常。圖 5 染色質(zhì)控圖圖 6 雜交質(zhì)控圖
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本文編號：2851843