研究背景特應性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種多因素影響的慢性炎癥性皮膚疾病,主要特征為皮膚干燥,嚴重瘙癢,紅斑病變。目前發(fā)病機制尚未明確,免疫反應調節(jié)異常和表皮屏障缺陷在AD的發(fā)展中起著重要作用。近些年,越來越多的證據(jù)表明,一些新的易感基因與AD患者的表皮屏障功能與先天性和適應性免疫有關。本研究團隊于2011年首次進行了中國漢族人AD全基因組關聯(lián)分析(genome-wide association,GWAS)研究,發(fā)現(xiàn)了5q22.1區(qū)域是AD新的易感區(qū)域,通過對該區(qū)域進行功能學分析及生物信息學預測,提示該區(qū)域TMEM232基因可能是中國漢族人群AD的易感基因,通過免疫組織化學研究發(fā)現(xiàn),在AD和正常組織中TMEM232的蛋白表達有所不同。研究目的本課題擬通過對5q22.1區(qū)域的單倍型分析和靶向捕獲測序研究該區(qū)域的易感基因功能變異,并通過功能學實驗來初步驗證該基因與AD的關聯(lián)。研究方法課題組共納入3055名漢族AD患者以及4346名對照,利用前期GWAS數(shù)據(jù)和基因分型信息結果,提取4個單核苷酸多態(tài)性(SNP)和6個插入缺失(Insertion/deletion,Indel)變異數(shù)據(jù),針對每個個體利用PHASE v 2.1軟件進行該區(qū)域的單倍型構建,用SPSS 13.0軟件通過卡方檢驗統(tǒng)計病例組和對照組之間單倍型頻率差異,尋找與AD有關聯(lián)的單倍型。隨后我們把含有統(tǒng)計學意義最強的單倍型樣本挑選出來,再從這些樣本中篩選高頻率(0.5%頻率)單倍型且盡量篩選純合子,當純合子樣本量少可以選擇雜合子,另外再篩選2例不含此單倍型樣本作為參照。接著我們對挑選出來的樣本在BGISEQ-500測序平臺進行高通量靶向區(qū)域捕獲測序,以找出有意義的基因功能變異;最后進一步對發(fā)現(xiàn)的基因進行Ha Ca T細胞轉染實驗,我們將實驗性Ha Ca T細胞等分為三組:用p CMV6-Entry-gene轉染的細胞,用p CMV6-Entry(Vect)轉染的細胞和不用DNA轉染的細胞(Con)。然后通過免疫印跡測量Ha Ca T細胞中的基因的表達,MTS法評估細胞增殖。最后,用1.5m M Ca Cl2處理轉染細胞,然后通過蛋白質印跡測量分化標志物INV和LOR探索其對細胞增生和分化的影響。研究結果本研究一共發(fā)現(xiàn)了60種單倍型,8種常見的單倍型分別為H1,H2,H11,H15,H25,H37,H59,H60(頻率0.5%),其中H15單倍型(GA CTG CA TAGCTAAGTACA)與AD顯著相關(P=2.72E-10,OR=0.14,95%CI=0.07-0.28),在病例中頻率為0.13%,對照組中為0.95%,病例組頻率明顯低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義;我們根據(jù)篩選原則挑出16個樣本,其中只有1例H15純合子,其他均為雜合子,通過對樣本進行靶向測序分析未發(fā)現(xiàn)顯著的突變位點,但進一步的統(tǒng)計檢驗表明在某些功能區(qū)域,僅有基因TMEM232與H15存在統(tǒng)計學顯著性(P=7.33E-5,OR=0.33,95%CI=0.19-0.58)。在Ha Ca T細胞轉染功能實驗中發(fā)現(xiàn)在構建過表達載體p CMV6-Entry-TMEM232(TMEM232)質粒組的細胞活力比在質粒空載體p CMV6-Entry(Vect)組以及用無DNA轉染(Con)組的細胞活力低(所有P0.05)。此外,我們發(fā)現(xiàn)在Ca2+刺激的條件下,與Vect和Con組相比,TMEM232抑制內披蛋白(Involucrin,INV)和兜甲蛋白(Loricrin,LOR)的表達(均P0.05)。研究結論本研究驗證了H15單倍型與AD的相關性,揭示TMEM232基因可能在AD中發(fā)揮著重要作用。且TMEM232的過表達抑制Ha Ca T細胞的體外增殖和分化。
【學位單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：R758.2
【部分圖文】：

2 5q22.1 區(qū)域 10 驗證位點 LD 圖ig 2 The LD diagram of ten variants in 5q22.1 region..5.6 Target Capture Sequencing二代測序.5.6.1 測序樣本選擇本次測序實驗要求DNA濃度≥20ng/ul，體積40ul以上。我們參考目前提取NA樣本質量，計劃挑選階段進入5q22.1區(qū)域內的常見的單倍型樣本用于進一步(位點選擇及單倍型構建見下面步驟)。樣本篩選有以下幾個步驟：首先，把各本的單倍體基因型列出來，優(yōu)先選擇出含最具有統(tǒng)計學意義的單倍型的樣本次，我們從這些樣本中篩選含單倍型頻率較高的樣本，以確保表示每個高頻> 0.5％）單倍型都包括進去；第三，我們盡量篩選純合子，當沒有足夠數(shù)量合子時，也可以選擇部分雜合子。

圖 4 TMEM232 在 HaCaT 中的表達情況Fig 4 The expression of TMEM232 in HaCaT cellsCon：HaCaT 細胞；Vect：用 pCMV6-Entry 轉染的 HaCaT 細胞。與 Con 和 Vect 組相比，TMEM232組中 TMEM232 蛋白表達豐富，P <0.05。3.7.2 TMEM232基因過表達抑制細胞生長為了確定TMEM232的過表達是否影響HaCaT細胞的生長，我們進行了MTS測定實驗以評估細胞增殖。通過比較細胞孵育2小時后，3組細胞在390nm處的吸光度來分析細胞活力。數(shù)據(jù)顯示TMEM232組的細胞活力分別低于Con和Vect組（均P<0.05）（圖5）。

TMEM232 在 HaCaT 中的表達情況 The expression of TMEM232 in HaCaT cellsHaCaT 細胞；Vect：用 pCMV6-Entry 轉染的 HaCaT 細胞 TMEM232 蛋白表達豐富，P <0.05。 TMEM232基因過表達抑制細胞生長為了確定TMEM232的過表達是否影響HaCaT細驗以評估細胞增殖。通過比較細胞孵育2小時后析細胞活力。數(shù)據(jù)顯示TMEM232組的細胞活5）（圖5）。
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本文編號：2844966